Search

Search results

Number of search hits: 491

Test22 (Pages)

rusztowaniu ważne jest, aby zachować sterylność. Zatem nanosrebro, w szczególności w postaci nanorurek, jest obiecującym materiałem do budowy podłoży dla hodowanych komórek ze względu na silne właściwości bakteriobójcze, jak i dzięki dużej wytrzymałości fizycznej i biokompatybilności. [Czytaj dalej] Cytochrom P450 Cytochromy występują w organizmach żywych, tj. bakteriach, grzybach, roślinach, zwierzętach, a także u ludzi. Oprócz dojrzałych erytrocytów znajdziemy je, w każdym typie komórek ssaczych. Wysoka aktywność enzymów CYP stwierdzana jest w siateczce śródplazmatycznej hepatocytów oraz w komórkach występujących w płucach, sercu, mózgu i nerkach (...). Izoenzymy cytochromu P450 biorą udział w biotransformacji ksenobiotyków tj. leków oraz związków endogennych. Odgrywają kluczową rolę w przemianach toksyn i procesach kancerogenezy. Enzymy te powodują aktywację oraz inaktywację leków. Zaangażowane są także w metabolizm substancji obcych dla naszego organizmu, dostarczanych np. z pożywieniem. Reakcje I fazy przemian ksenobiotyków, w których biorą udział cytochromy P450 powodują, że powstałe produkty metabolizmu są lepiej rozpuszczalne w wodzie. Wykazują też zdecydowanie lepszą polarność. Ułatwia to wydalanie ksenobiotyków z organizmu. Za przemiany ponad 90% leków odpowiadają wspólnie izoenzymy: CYP2B6, 2C9, 2C19 i 2D6, które należą do rodzin CYP1-3. [Czytaj dalej] Zmienność w ludzkim genomie International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) podaje, że genom człowieka zawiera 3,08 mld nukleotydów. Ich ułożenie w sekwencję to informacja genetyczna, która stanowi wspólną cechę genomów wszystkich ludzi. Jednakże, każdy genom ludzki posiada charakterystyczny dla siebie zbiór różnic, zwanych zmiennością. Porównanie ich w obrębie różnych populacji oraz bezpośrednie zestawienie indywidualnych genomów spokrewnionych osób, wykazuje istnienie tzw. polimorfizmu (...). Warianty sekwencji obejmują do 0,1% euchromatyny człowieka. Większość z nich to polimorfizmy o charakterze zmian jednego nukleotydu (SNP – ang. single nucleotide polymorphism). Innymi zaobserwowanymi polimorfizmami są insercje i delecje oraz zmienności/warianty liczby kopii długich sekwencji DNA (CNV – ang. copy number variation). Według Słomskiego i in. (2008) termin polimorfizm dotyczy sekwencji DNA, dla której najrzadszy allel występuje w populacji z częstością 1% lub większą, w innym przypadku wariant sekwencji jest mutacją. Polimorfizm genetyczny, odpowiada w znacznym stopniu za zróżnicowanie w obrębie ludzkiej populacji. Różnice dotyczą cech fenotypowych, takich jak poziom markerów biochemicznych, stan zdrowia i wygląd zewnętrzny. Polimorfizm genetyczny może powodować choroby, zwiększać ryzyko zachorowania, zaostrzać objawy, przebieg choroby oraz modyfikować reakcje na zastosowaną. Do tej pory sądzono, że większość różnic stanowią polimorfizmy typu SNP. Najnowsze badania udowodniły, że w genomie człowieka występują także polimorfizmy CNV, które obejmują setki tysięcy par zasad łańcucha DNA. [Czytaj dalej] Metody w biotechnologii Metoda real-time PCR (qPCR) umożliwia jednoczesne namnażanie DNA oraz monitorowanie ilości produktów powstających podczas kolejnych cykli (amplikonów). Po raz pierwszy została ona zaprezentowana przez zespół Higuchi’ego z Roche Molecular Systems and Chiron. Dzięki dodatkowi bromku etydyny (EtBr) oraz przeprowadzeniu reakcji pod ultrafioletem udało się im wzbudzić fluorescencję barwnika i tym samym zwizualizować oraz nagrać proces amplifikacji. W skład mieszaniny reakcyjnej standardowej

Created on Nov 30, 2020

III Ogólnopolska Konferencja Naukowa IMPLANTY 2020 (Pages)

biomechaniki oraz aparatury medycznej. Konferencja ma zasięg ogólnopolski, odbędzie się w dniach 18-19 czerwca 2020 roku w Audytorium budynku Centrum Nanotechnologii B Politechniki Gdańskiej. Konferencja organizowana jest przez Zespół Biomateriałów oraz Koło Naukowe

Created on Jan 27, 2020

Nanosrebro (Pages)

rusztowaniu ważne jest, aby zachować sterylność. Zatem nanosrebro, w szczególności w postaci nanorurek, jest obiecującym materiałem do budowy podłoży dla hodowanych komórek ze względu na silne właściwości bakteriobójcze, jak i dzięki dużej wytrzymałości fizycznej i biokompatybilności [Krzosek 2015]. W kosmetologii nanosrebro wykorzystywane jest przede wszystkim ze względu na swoje właściwości biobójcze. Ponadto nanocząstki nie przenikają zbyt łatwo przez barierę skóry i wykazują skutecznie działanie przeciwko różnym grupom drobnoustrojów nawet przy niskich stężeniach. Na coraz częstsze zastosowanie nanocząstek srebra ma również jego stabilność chemiczna, aktywność biologiczna w szerokim zakresie temperatury i pH, dobra rozpuszczalność w wodzie oraz kompatybilność z innymi składowymi produktu [Rodewald 2013]. Nanosrebro jest obecnie stosowane w kosmetykach przeciwtrądzikowych, szamponach do włosów, żelach pod prysznic, chusteczkach antybakteryjnych, kremach, chusteczkach do higieny intymnej, w wodach kolońskich, chusteczkach do demakijażu, żelach po goleniu [Szlecht i Schroeder 2011]. Coraz częściej spotykane jest wykorzystanie nanocząsteczkowego srebra w budownictwie. Jest ono stosowane w materiałach takich jak: sidingi, izolacje, farby malarskie czy pokrycia dachowe. Zastosowanie nanometrycznego srebra sprawia, że materiały budowlane stają się odporne na działanie mikroorganizmów [Pulit i in. 2011]. Zastosowanie nanoczątek srebra w odkażaniu dokumentów archiwalnych i powierzchni obiektów historycznych jest wynikiem silnych właściwości przeciwdrobnoustrojowych nanosrebra. Zbadano, że nanostruktury srebra o stężeniu 90 ppm i rozmiarze od 10 do 100 nm są skuteczne w usuwaniu mikroorganizmów z badanych obiektów znajdujących się w muzeach i archiwach. Ponadto przy stężeniu wynoszącym 45 ppm usunięto 94% wszystkich drobnoustrojów z wyjątkiem bakterii takich jak Bacillus subtilis i Staphylococcus xylosus, które to wykazują oporność [Gutarowska i in. 2012]. Nanometryczne srebro znajduje także zastosowanie w ochronie środowiska pracy oraz środowiska naturalnego. Przeciwdrobnoustrojowe właściwości nanostruktur sprawiają, że są one wykorzystywane w systemach oczyszczana wody i powietrza z zanieczyszczeń pochodzenia biologicznego i chemicznego. W trakcie przeprowadzonych w 2008 roku badań ukazano, że fragmenty filtrów powietrza, które zostały zbudowane z włókna węglowego z dodatkiem nanosrebra o rozmiarach od 12 do 15 nm wykazują całkowite zahamowanie wzrostu drobnoustrojów takich jak Bacillus subtilis i Escherichia coli już po 10-minutowym kontakcie [Krzosek 2015]. Wyniki badań wskazują na to, że nanostruktury srebra niebawem znajdą powszechne zastosowanie w przemyśle spożywczym, gdzie stan powietrza pomieszczeń jest bardzo ważny dla zdrowia pracowników, jak również jakości produkowanej żywności. Nanotechnologia znajduje bardzo ważne zastosowanie w rolnictwie i produkcji zwierzęcej. Głównym zadaniem substancji wzbogaconych nanosrebrem jest sterylizacja wyposażenia i budynków inwentarskich i fermowych, szklarni, magazynów, narzędzi, miejsc składowania odchodów zwierzęcych, żywności, opakowań, pojemników do przechowywania ściółki i pasz. W produkcji zwierząt nanocząsteczki srebra są stosowane do odkażania wymion, kopyt i racic zwierząt gospodarskich [Czyż i in. 2011]. Toksyczność nanosrebra Powszechna obecność produktów zawierających nanocząstki srebra sprawia, że obawy odnośnie ich stosowania stają się coraz większe. Mimo tego, że nanostruktury od zawsze występują w naturze to dynamiczny wzrost ich produkcji oraz rozwój nanotechnologii sprawiły, że w ostatnich latach obserwujemy zwiększenie liczby badań nad efektem ich działania na eukarionty i środowisko naturalne [Wolska i in. 2017]. Nanocząsteczki zwykle charakteryzują się innymi właściwościami niż ich odpowiedniki w makroskopowej skali. Dlatego też badania nad toksycznością powinny być przeprowadzane osobno dla nanomateriałów. W przypadku zastosowań biologicznych zmniejszenie rozmiaru metalu do skali nanometrycznej wiąże się ze wzrostem cytotoksyczności [Runowski 2014]. Jest to związane między innymi z większą powierzchnią czynną, przez co zwiększoną reaktywnością i oddziaływaniem z innymi związkami w otoczeniu w porównaniu z materiałami konwencjonalnymi. Wykazują się one również wyższą bioprzyswajalnością, przez co łatwiej ulegają adsorpcji w konkretnych narządach, tkankach i komórkach. Ponadto nanostruktury zachowują się jak nośniki zanieczyszczeń, zwiększając ich rozprzestrzenianie w środowisku. [Czyż i in. 2011]. Aby rzetelnie ocenić ryzyko wykorzystywania nanostruktur należy uzyskać informacje na poziomie pojedynczych organizmów, grup organizmów, jak i całych ekosystemów [Kahru i Dubourguier 2010]. Zagrożeniem dla środowiska naturalnego najczęściej stają się nanocząsteczki projektowane. Biorąc pod uwagę ich obieg, stwierdza się, że przenikają one do systemów naturalnych, takich jak powietrze, woda oraz gleby przez ścieki przemysłowe i komunalne oraz w postaci substancji dodawanych do środków ochrony roślin. Potencjalnym zagrożeniem dla środowiska jest bioakumulacja nanocząstek w tych systemach. Ważną kwestią w ocenie toksyczności nanostruktur projektowanych jest określenie czy i w jakim stopniu ulegają one degradacji w środowisku [Baun i in. 2009; Bystrzejewska-Piotrowska i in. 2009; Brar i in. 2010]. Nanostruktury srebra wykazują się dużą aktywnością biobójczą. Przenikając do środowiska naturalnego, stanowią poważny problem w prawidłowym funkcjonowaniu ekosystemów, w szczególności mikroorganizmów występujących w glebie. Nanosrebro eliminując podatne na jego działanie gatunki obniża ich bioróżnorodność. Stanowi ono zagrożenie dla drobnoustrojów stosowanych w procesach bioremediacji gruntów i biodegradacji zanieczyszczeń. Ponadto nanocząstki srebra zagrażają bakteriom z rodzaju Bradyrhizobium, które to odpowiedzialne są za wiązanie azotu, co może prowadzić do zaburzenia cyklu obiegu pierwiastków [Kumar i in. 2011]. Nanocząsteczki przedostają się do środowiska naturalnego ze źródeł powierzchniowych lub punktowych. Źródła punktowe to oczyszczalnie ścieków, spalarnie i składowiska odpadów oraz miejsca produkcji nanostruktur. Natomiast powierzchniowe źródła są związane z uwalnianiem nanocząstek poprzez użytkowanie produktów, które je zawierają [Vlachogianni i Valavanidis 2014]. Przykładem źródła tego rodzaju jest uwalnianie jonów srebra i srebra w postaci koloidalnej ze skarpetek zwierających nanosrebro [Benn i Westerhoff 2008]. Ponadto Farkas (i in.) w swoich badaniach wykazali, że w wodach odpływowych z pralki, wzbogaconej o nanosrebro, jego zawartość wynosiła 11 ľg / l [Farkas i in. 2011]. Przedostawanie się nanocząstek do atmosfery następuje w spalarniach podczas utylizacji produktów zawierających nanostruktury. Jest ona obciążona tego typu zanieczyszczeniami w mniejszym stopniu porównując ją do innych systemów naturalnych. Związane jest to ze stosunkowo niedługim czasem przebywania nanocząstek mniejszych niż 100 nm w atmosferze [Vlachogianni i Valavanidis 2014]. Stopień zagrożenia wód gruntowych jak i powierzchniowych przez nanometale jest nieznany. Jednakże potencjalne zagrożenie wynikające z ich transportu do tych zbiorników wodnych może być większe niż sądzono, gdyby nanosrebro tworzyło stabilne zawiesiny w wodzie. Z tego względu istnieje potrzeba określenia dokładnego zachowania i mobilności nanostruktur srebra w środowisku [Tolaymat i in. 2010]. Toksyczność, biodostępność i mobilność nanosrebra jest uwarunkowana stabilnością koloidalną, na którą wpływają czynniki takie jak warunki środowiskowe, pH czy siła jonowa [Römer i in. 2011]. Badania wykazują, że naturalne substancje organiczne, które występują w wodzie, wpływają znacząco na właściwości srebra, co ma wpływ na toksyczność i transport nanometrycznego srebra w środowisku wodnym [Delay i in. 2011]. Wykazano, że nanocząstki srebra wykazują toksyczne działanie na organizmy wodne. Działają one niekorzystnie między innymi na pstrąga tęczowego uszkadzając jego hepatocyty [Farkas i in. 2010] czy wywierając niekorzystny wpływ na zarodki danio pręgowanego [Massarsky i in. 2013]. Ocenę ryzyka dla środowiska, wywołanego przez nanostruktury, wykonuje się porównując przewidywane stężenie badanej substancji w środowisku (PEC) do stężenia tego związku bez przewidywanego działania w środowisku (PNEC). Jeśli współczynnik PEC/PNEC jest ≤ 1, to nie występuje ryzyko dla środowiska, natomiast, gdy PEC/PNEC > 1, to takie ryzyko istnieje [Gruszecka i Helios-Rybicka 2009]. Pierwotnie nanocząstki srebra uważane były za nietoksyczne dla komórek zwierząt. Ich przedawkowanie wiązało się jedynie z efektem ubocznym, który objawiał się zmianą pigmentacji skóry, zwaną srebrzycą. Niemniej jednak ostatnie badania coraz częściej ukazują toksyczne działanie nanosrebra, zwłaszcza wobec ssaków. W wielu badaniach wykazano, że nanocząstki srebra mogą się dostać do organizmu przez drogę pokarmową oraz inhalacyjną. Natomiast badania nad przedostawaniem się AgNPs drogą dermalną nie są jednoznaczne. Poprzez wdychanie, nanosrebro dociera do płuc, skąd jest wchłaniane do krwioobiegu. W ten sposób dostaje się ono do narządów wewnętrznych. Drogą pokarmową nanocząsteczki przedostają się do jelit, a następnie są wchłaniane do krwi i dalej do innych organów, podobnie jak ma to miejsce przy inhalacji [Świdwińska-Gajewska i Czerczak 2014]. Większość doświadczeń, w których bada się toksyczność nanosrebra, prowadzona jest w warunkach in vitro. Jak dotąd eksperymenty wykonywano na komórkach ryb, glonów, skorupiaków, pierwotniaków i nicieni oraz na liniach komórkowych pochodzących od ssaków [Bondarenko i in. 2013]. Badania in vivo przeprowadzano na kawii, myszach, szczurach, królikach, rybach oraz na świni domowej [Likus i in. 2013]. W doświadczeniach, w których nanocząsteczki srebra dostawały się do organizmu poprzez inhalację, zauważono, że mają one wpływ głównie na wątrobę i płuca, gdzie powodowały procesy zapalne i zmiany histopatologiczne. U zwierząt narażanych drogą pokarmową, obserwowano zmiany histopatologiczne jelit, wzrost aktywności enzymów oraz procesy zapalne w wątrobie i jelitach. Nanocząsteczki docierając do mózgu wywoływały efekty neurotoksyczne między innymi powodując zaburzenia pamięci krótkotrwałej oraz obniżenie wyników oceniających funkcje poznawcze. Ponadto Park (i in.) wykazali genotyksyczne działanie nancząstek srebra. W badaniach w warunkach in vitro wykorzystując test kometowy i mikrojądrowy uzyskano wyniki, które świadczyły o uszkodzeniu DNA komórek [Park i in. 2011]. Jednakże w badaniach in vivo nie udało się potwierdzić takiego działania srebra. Istnieją również niepokojące wyniki, które ukazują szkodliwy wpływ AgNPs na rozrodczość. Badając gryzonie, odnotowano, że nanosrebro wpływa między innymi na opóźnienia pokwitania, obniżenie poziomu hormonów płciowych, a także na pogorszenie jakości nasienia [Świdwińska-Gajewska i Czerczak 2014]. Ze względu na szybki rozwój nanotechnologii i wprowadzenie nanocząstek do wielu produktów użytkowych należy zastanowić się nad ich bezpieczeństwem. Z racji tego, że większość badań toksyczności nanocząsteczek srebra opiera się na eksperymentach komórkowych in vitro i stosunkowo krótkotrwałych eksperymentach na zwierzętach, należy zwrócić szczególną uwagę na wpływ nanosrebra na ludzi, szczególnie narażonych zawodowo. Obecnie w Polsce obowiązuje najwyższe dopuszczalne stężenie srebra (NDS), które dotyczy frakcji wdychanej, wynoszące 0,05 mg/m3. Natomiast nie zostało do tej pory ustalone najwyższe dopuszczalne stężenie pułapowe ani najwyższe dopuszczalne stężenie chwilowe. Normatyw ten został ustalony w 1983 roku [Dz.U. z 2014 r., poz. 817]. Ze względu na wyniki badań, które zostały przeprowadzone w ostatnich latach, które wskazują na szkodliwe działanie nanosrebra, istnieje potrzeba zaktualizowania NDS dla srebra, wyodrębniając wartości dla frakcji nanocząstek. Metody syntezy nanosrebra W celu syntezy nanocząstek stosuje się dwie główne strategie. Pierwsza z nich — bottom-up — opiera się na osiągnieciu skali nano poprzez budowę od podstaw, począwszy od pojedynczych atomów, przez dodawanie kolejnych. W zależności od pożądanych właściwości końcowego produktu, materiałem budulcowym mogą być atomy, cząsteczki lub nanostruktury. Ze względu na możliwość dużej kontroli nad rozmiarem, metoda bottom-up jest najczęściej stosowaną metodą syntezy nanocząstek. Druga grupa metod — top-down — polega na podziale makroskopowego materiału na cząsteczki o rozmiarach nanometrycznych [Kelsall i in. 2008]. Ideę tych dwóch strategii przedstawia poniższy schemat. Ryc. 1. Schematycznie przedstawienie metod bottom-up i top-down [Kelsall R.W., Hamley I.W., Geoghegan M. 2008. Nanotechnologie. Tłum. i red. K. Kurzydłowski. PWN. Warszawa: 31.] Najczęściej syntetyzuje się nanocząsteczki srebra na drodze chemicznej. Zalety tych metod to precyzja w modelowaniu wielkości nanocząstek, łatwość prowadzenia syntezy, jej krótki czas oraz niskie koszty. Najbardziej powszechnym podejściem do chemicznych metod wytwarzania AgNPs jest redukcja soli srebra organicznymi i nieorganicznymi środkami redukującymi i stabilizacja powstałego roztworu. Morfologia nanosrebra może być kontrolowana przez dobranie odpowiednich parametrów syntezy oraz stężeń odczynników. Uzyskanie większych nanocząstek wiąże się ze zmniejszeniem stosunku molowego soli srebra do reduktora. Natomiast mniejszy stosunek spowoduje powstanie mniejszych nanocząsteczek. Również dobierając odpowiednią molowość soli i stabilizatora można modyfikować wielkość cząstek [Malina i in. 2010]. Najczęściej wykorzystywanym źródłem atomów srebra, ze względu na stałe tempo syntezy przez całą reakcję, jest AgNO3. Ponadto stosuje się również sole takie jak AgPF6, AgBF4 czy AgClO4, jednakże wykazują się one zmniejszeniem szybkości reakcji już po około 10 minutach jej trwania. Do redukcji jonów srebra stosuje się: kwas askorbinowy, D-glukozę, etanol, utropinę, hydrochinon, formaldehyd, kwas galusowy, cytrynian sodu, bromowodorek sodu, DMD, odczynnik Tollensa oraz glikol etylenowy. W procesie syntezy powstaje zawiesina nanocząstek srebra, która wykazuje predylekcję do tworzenia agregatów. Dlatego też istotne jest dodawanie substancji stabilizujących. Najczęściej stosuje się związki, takie jak: PVP, PVA, SDS, CTAB, oraz PMAA. Warto zaznaczyć, że związki takie jak na przykład kwas galusowy lub cytrynian sodu mogą pełnić rolę stabilizatora jak i reduktora [Malina i in. 2010, Iravani i in. 2014]. Syntezę nanocząstek srebra, wykorzystującą redukcję chemiczną, można podzielić na trzy etapy. W pierwszym z nich dochodzi do przekazania elektronów z reduktora na jony srebra Ag+, co jest wynikiem reakcji redoks. Po redukcji powstają wolne atomy srebra Ag0, które zderzając się ze sobą tworzą 1-2 nm jądra. W kolejnym etapie dochodzi do wzrostu nanocząstek polegającym na dalszej redukcji kationów srebra na powierzchni powstałych jąder. Etap trzeci polega na dodaniu stabilizatora, który zapobiegnie agregacji nanometrycznych cząstek [Malina i in. 2010]. Syntezę nanocząstek na drodze redukcji chemicznej przedstawia poniższy schemat. Ryc. 2. Schemat tworzenia nanocząsteczek srebra na drodze redukcji chemicznej [Malina D., Sobczak-Kupiec A., Kowalski Z. 2010. Nanocząstki srebra – przegląd chemicznych metod syntezy. Chemia. Czasopismo Techniczne, 107, 10: 183- 192.] Nanostruktury srebra są również otrzymywane z wykorzystaniem mikroemulsji, które tworzą systemy odwróconej miceli. Są to mieszaniny składające się z wody, surfaktanta, oleju oraz kosurfaktanta. Synteza AgNPs polega na połączeniu dwóch mikroemulsji, gdzie jedna z nich zawiera reduktor, natomiast druga sole srebra. Metoda ta składa się z pięciu etapów. Pierwszy z nich polega na zderzeniu odwrotnych miceli i wymianie reagentów. W kolejny etapie następuje otwarcie warstwy surfaktanta. Prowadzi to do wymiany reagentów między micelami wskutek dyfuzji. Następnie dochodzi do nukleacji. Ostatnim etapem jest zamknięcie i wzrost miceli zawierającej nanocząsteczkę srebra. System odwróconej miceli pozwala na dokładne określenie wielkości nanocząstek poprzez zmianę średnicy mikrokropli [Malina i in. 2010]. Syntezę z wykorzystaniem tej metody przedstawia poniższy schemat. Ryc. 3. Schemat tworzenia nanocząsteczek srebra w systemie odwrotnej miceli [Zhang W., Qiao X., Chen J. 2007. Synthesis of silver nanoparticles—Effects of concerned parameters in water/oil microemulsion. Materials Science and Engineering: B, 142, 1: 1-15.] Jednym z fizykochemicznych sposobów syntezy nanocząstek srebra jest wykorzystanie ablacji laserowej. Jest to metoda polegająca na odparowaniu materiału z powierzchni ciała stałego do plazmy lub stanu gazowego, pomijając stan ciekły. Do ablacji wykorzystuje się lasery pracy ciągłej, bądź impulsowe, gdzie stosuje się wiązkę lasera o dużej mocy. Źródłem srebra jest „target”, który wykonany jest z czystego metalu. Z jego powierzchni, przy użyciu lasera, odparowuje się atomy metalu. Przedostają się one do roztworu, gdzie są otaczane przez cząsteczki substancji stabilizującej, na przykład przez SDS. W ten sposób dochodzi do formowania nanocząsteczek srebra [Krajczewki i Kudelski 2015]. Nanosrebro wytwarzane jest także z użyciem metody sonochemicznej. Polega ona na redukcji jonów Ag+ w atmosferze gazu obojętnego wykorzystując ultradźwięki o częstotliwości 20-50 kHz. Synteza przeprowadzana jest w temperaturze 10oC w wodzie. Rozpada się ona pod wpływem ultradźwięków wytwarzając wolne rodniki H• oraz HO•. Następnie jony srebra reagują z rodnikiem wodorowym zgodnie z poniższym równaniem: Wadą tej metody jest niski stopień kontroli morfologii nanocząstek. Ich rozmiar jest zależny przede wszystkim od stężenia prekursora w roztworze, który jest poddawany działaniu ultradźwięków [Żelechowska 2014, Wolska i in. 2017]. Fotochemiczna metoda syntezy AgNPs polega na redukcji jonów srebra przy użyciu promieniowania ultrafioletowego. W jednym z zastosowań tej metody stosuje się sole srebra, izopropanol oraz aceton. Pod wpływem UV cząsteczka acetonu jest wzbudzana i reagując z cząsteczką izopropanolu uwalnia dwa wolne rodniki. Następnie reagują one z jonami srebra i redukuje je do Ag0, jak na równaniu: Zaletą fotochemicznej syntezy jest precyzyjna kontrola rozmiaru nanocząstek poprzez zmianę długości fali stosowanego światła. Pozwala to otrzymać mały rozrzut wymiarów nanostruktur srebra, które mają wielkość kilku nanometrów. Z kolei wadą tej, jak i większości metod fotochemicznych, jest ograniczenie objętości roztworu poddawanego naświetlaniu [Żelechowska 2014, Krajczewki i Kudelski 2015]. Elektrochemiczna metoda syntezy nanocząstek srebra jest stosunkowo rzadko stosowana ze względu na duże koszty prowadzenia procesu. Przy jej użyciu uzyskuje się materiały o bardzo dużej czystości, dzięki czemu znajdują one zastosowanie w farmacji, medycynie oraz kosmetyce. Wytwarzanie nanocząsteczek odbywa się poprzez redukcję srebra przy użyciu cyklicznej woltamerii lub metody galwanostatycznej. Pierwsza z nich polega na wykorzystaniu platynowej blaszki (elektroda pomocnicza), srebrnego pręta (elektroda pracująca) oraz elektrody odniesienia – Ag/AgCl. System ten zanurzany jest w roztworze NaNO3. Druga z metod wykorzystuje dwa srebrne druty, które służą jako katody, oraz trzy srebrne elektrody anodowe [Malina i in. 2010]. Początkowo elektrochemiczna synteza nanocząstek metali przeprowadzana była w układzie dwuelektrodowym, gdzie anodą była srebrna blaszka, natomiast katoda wykonana była z platyny. Elektrody zanurzane były w mieszaninie acetonitrylu oraz tetrahydrofuranu z dodatkiem soli tetraalkiloamoniowej [Żelechowska 2014]. Pierwotną metodą przedstawia Rycina 4. Ryc. 4. Schemat tworzenia nanocząsteczek srebra na drodze elektrochemicznej [Żelechowska K. 2014. Nanotechnologia w chemii i medycynie. Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej. Gdańsk.] Stabilizatorami stosowanymi w tej metodzie są między innymi sole tetraoctyloamonowe, PEG, PVP oraz DNA. Wykorzystanie matrycy DNA umożliwia wytworzenie nanocząstek srebra o różnej długości [Jin i in. 2011]. Synteza elektrochemiczna jest stosowania również bez użycia związków stabilizujących, gdzie morfologia powstających nanostruktur jest modyfikowana poprzez zmianę parametrów procesu, takich jak gęstość prądu oraz potencjał elektrod [Wolska i in. 2017]. Poza fizykochemicznymi i chemicznymi metodami, do wytwarzania nanocząsteczek srebra, stosuje się syntezę fizyczną. Polega ona na ogrzewaniu srebra w wysokiej temperaturze, wskutek czego zostaje ono odparowane, co prowadzi do powstawania jonów srebra. Następnie w procesie nukleacji powstają zarodki, które przekształcają się w nanocząstki. Podczas chłodzenia następuje kondensacja nanosrebra. Z użyciem tej metody powstają nanocząsteczki, które są jednolite wielkościowo. Ponadto nie stosuje się związków, które mogłyby zanieczyścić syntetyzowany materiał. Natomiast jedną z wad fizycznego wytwarzania AgNPs jest zastosowanie pieca, który zajmuje dużą powierzchnię oraz wymaga użycia energii powyżej kilku kilowatów [Iravani i in. 2014]. Biologiczne metody syntezy nanocząstek są szybkie oraz generują niskie koszty. Ponadto są przyjazne dla środowiska, co sprawia, że stają się one konkurencyjne dla metod chemicznych. W celu wytworzenia nanosrebra stosuje się mikroorganizmy, białka, witaminy oraz ekstrakty roślinne. Synteza AgNPs przy użyciu białek wymaga obecności niewielkich skupisk srebra metalicznego, do którego, poprzez adhezję, przyłączają się peptydy. W następstwie tego tworzy się środowisko redukcyjne, gdzie kationy srebra są redukowane i dochodzi do wzrostu kryształu, który osiąga rozmiar od 60 do 150 nm [Naik i in. 2002]. Zastosowanie mikroorganizmów w syntezie może dziwić, ze względu na biobójcze właściwości nanosrebra. Wybrane drobnoustroje posiadają takie zdolności ze względu na zwiększoną oporność na toksyczność. Do tej pory opisanych zostało kilkanaście organizmów mogących prowadzić syntezę. Pierwsza informacja dotycząca biosyntezy AgNPs dotyczyła bakterii Pseudomonas stutzeri AG259, która jest organizmem naturalnie występującym w kopalniach srebra. Hodowana na podłożu płynnym z dodatkiem AgNO3 gromadzi wewnątrz swoich komórek cząstki srebra o rozmiarach 20-50 nm [Klaus i in. 1999]. Grzyb Alternaria alternata posiada podobne zdolności. Wykazuje się on zewnątrzkomórkową syntezą nanostruktur srebra o wymiarach 20-60 nm [Gajbhiye i in. 2009]. Również Bacillus subtilis potrafi syntetyzować poza swoją komórką nanocząstki w obecności jonów srebra. Tak jak w przypadku chemicznych metod, biosynteza polega na redukcji jonów srebra do wolnego metalu. Mikroorganizmy wykorzystują do tego wysoką aktywność reduktazy azotanowej, która indukowana jonami srebra, redukuje je w obecności NADH i innych białek [Wolska i in. 2017]. Enzym ten z powodzeniem jest stosowany również w warunkach in vitro tworząc nanostruktury srebra o rozmiarach 10-25 nm, które stabilizuje się fitochelatyną [Kumar i in. 2007]. Biosynteza nanosrebra może zachodzić także przy użyciu ekstraktów roślinnych. Shankar (i in.) opisali wytwarzanie nanocząstek przez redukcję AgNO3 z wykorzystaniem wyciągu z pelargonii pachnącej (Pelargonium graveolens). Powstałe struktury miały wielkość od 16 do 40 nm [Shankar i in.]. Do redukcji srebra przyczyniają się obecne w roślinie polifenole. Do syntezy nanocząsteczek srebra stosowane są również ekstrakty z roślin takich jak bazylia, aloes, sosna, magnolia czy miłorząb. W biosyntezie znane jest także zastosowanie ekstraktów z warzyw oraz owoców takich jak banany czy pomarańcze [Siemieniec i Kruk 2014]. Mechanizmy działania nanosrebra na bakterie Coraz częstszym zastosowaniem spośród najnowszych rodzajów środków biobójczych wyróżnia się nanosrebro. Jego antybakteryjne właściwości znane są od dawna. Sole oraz koloidy srebra były stosowane już w wieku XIX w prewencji i leczeniu infekcji wywoływanych przez mikroorganizmy [Sintubin i in. 2012]. Współcześnie terapeutyczne znaczenie nanocząsteczek srebra wzrasta ze względu na brak skutecznych leków przeciwdrobnoustrojowych. Srebro jonowe zostało wyparte z użycia na rzecz nanocząstek srebra, ponieważ było podatne na tworzenie kompleksów precypitacji, przez co ulegało inaktywacji. Nanosrebro jest potencjalnie bezpieczniejsze, a jego właściwości bakteriobójcze mogą być dodatkowo wzmacniane, między innymi, przez dodatek stabilizatorów [Wolska i in. 2017]. Ściana komórkowa bakterii zbudowana jest głównie z mureiny, która składa się z długich łańcuchów polisacharydowych, połączonych mostkami peptydowymi. W przypadku

Created on Sep 05, 2019

Nanotechnologia (Pages)

dziedzinie fizyki. W wykładzie, o wiele mówiącym tytule: „There’s Plenty of Room at the Bottom”, przedstawił koncepcję budowy nanosystemów przez miniaturyzację. Zastanawiał się on czy możliwe jest umieszczenie 24-tomowej Encyklopedii Brytannici na główce od szpilki [Feynman 1960]. Natomiast terminem „nanotechnologia” posłużył się, jako pierwszy prof. Norio Taniguchi w 1974 roku w wystąpieniu zatytułowanym: „On the Basic Concept of ‘Nano-Technology’”. Użył on tego słowa na określenie obróbki z dokładnością do 1 nm [Taniguchi 1974]. Nanotechnologię, jako jeden z pierwszych, zdefiniował w 1987 roku A. Franks. Określa ją jako wytwarzanie materiałów o rozmiarach lub tolerancji wymiarów w przedziale od 0,1 do 100 nm [Franks 1987]. Z kolei 5 lat później, inny amerykański uczony — K. Eric Drexler, nieco inaczej opisuje nanotechnologię. Definiuje ją jako technologię bazującą na produkcji molekularnej, kiedy to produkty są tworzone poprzez manipulowanie cząsteczkami [Drexler 1992]. Kamieniem milowym w rozwoju tej nauki było zbudowanie skaningowego mikroskopu tunelowego, dzięki któremu stworzono nanostruktury o rozmiarach 40-70 nm. Z wykorzystaniem mikroskopu

Created on Sep 04, 2019

Cytochrom P450 (Pages)

jednak w wątrobie i jelicie cienkim. To w tych narządach zachodzą najważniejsze procesy detoksykacji (Pelkonen i in., 2008). Budowa cytochromu P450 ssaka została poznana m.in. dzięki strukturze krystalicznej bakteryjnych enzymów P450 oraz modelowaniu molekularnemu cząsteczek. Wiadomo, że w cytochromie znajdują się regiony, które odpowiadają za wiązanie substratów, hemu oraz transport elektronów. To hemoproteiny, które różnią się pierwszorzędową strukturą. Centrum aktywne hemu stanowi żelazo (Bogacz, 2009). Wiśniewska i Mazerska (2009) opisują centrum porfirynowo-żelazowego cytochromu P450, jako atom żelaza związany koordynacyjnie z czterema atomami azotu pierścienia porfirynowego i dwoma osiowymi ligandami, z których jeden stanowi reszta cysteiny. W stanie spoczynku kompleks porfiryny występuje w równowadze pomiędzy strukturą pięciokoordynacyjnego wysokospinowego jonu Fe(III) z resztą cysteiny jako ligandem i sześciokoordynacyjnego niskospinowego jonu Fe(III) z cząsteczką wody w pozycji trans w odniesieniu do reszty cysteiny. Enzym CYP450 był pierwszym, dla którego udało się określić sekwencję aminokwasową. Został on wyizolowany z hepatocytów szczura. Enzymy P450 dzięki sekwencji hydrofobowej (sygnałowa sekwencja kotwicząca) na swoich N – końcach, mogą zakotwiczyć się w błonie komórkowej (Bogacz, 2009). Porównanie budowy przestrzennej, głównych enzymów CYP sugeruje, że ich trzeciorzędowa struktura jest identyczna. Złożone są z 16 łańcuchów aminokwasowych, z czego 12 posiada strukturę α-helisy a 4 β-harmonijki (Sansen i in., 2007). Enzymy cytochromu P450 wraz z tlenkiem węgla, tworzą kompleks, który wykazuje maksimum absorbancji przy długości fali – 450nm (Hames i Hooper, 2012). Cytochromy P450 należą do nadrodziny monooksygenaz (Szaefer i in., 2013). To enzymy katalizujące reakcje, w których jeden z atomów tlenu wprowadzony zostaje do cząsteczki substratu powodując jego hydroksylację, drugi natomiast ulega redukcji do wody (Hames i Hooper, 2012; Botham i Mayes, 2018). Elektron z NADPH zostaje przejęty przez enzymy P450 i zostaje przeniesiony na cząsteczkę tlenu. Na drodze monooksygenacji, enzymy CYP katalizują reakcję utleniania egzo- i endogennych związków chemicznych (Wiśniewska i Mazerska, 2009). Proces ten zachodzi zgodnie z reakcją: RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+, gdzie RH - substrat, ROH - produkt Mimo, że cytochrom P450 występuje w łańcuchu oddechowym jako końcowy element, jego rolą jest hydroksylacja substratów (Stryer, 2003). Związanie substratu z cząsteczką białka grupy hemowej, inicjuje cykl katalityczny cytochromu P450. Grupa ta po pobraniu elektronu z NADPH, prowadzi do redukcji Fe3+ do Fe2+, który wiąże się z cząsteczką tlenu i tworzy addukt Fe2+-O2 (Bogacz, 2009). Fe3+ połączony z substratem znajduje się w pięciokoordynacyjnym stanie. Jego potencjał redukcyjny wynosi -170mV. Fe3+, który w stanie sześciokoordynacyjnym posiada potencjał niższy (-270mV). Taka różnica w potencjałach zwiększa szybkość redukcji atomu żelaza (Wiśniewska i Mazerska, 2009). Addukt Fe2+-O2 ulega konformacji do trwalszego kompleksu Fe3+-O2-• (Bogacz, 2009). Następnie przyjęty elektron powoduje utlenienie żelaza do Fe3+ i powstaje Fe3+-O22-. Kompleks ten oddziałuje z protonem, pochodzącym ze środowiska, przez co wiązanie O-O rozpada się, tworzy się cząsteczka H2O oraz kompleks Fe3+=O. Rodnik wodorowy pochodzący z substratu, zostaje przyjęty przez ten kompleks i powstaje Fe3+-O•H. Drugi, niesparowany elektron pozostaje w cząsteczce substratu. Wspomniane dwa rodniki ulegają przemianie i tworzą produkt zawierający grupę hydroksylową. Następuje odłączenie otrzymanego produktu, a cytochrom P450 zostaje odtworzony (Isin i Guengerich, 2007). U człowieka, w błonach retikulum endoplazmatycznego, znajduje się specjalny system transportu, dzięki któremu możliwe jest przeniesienie elektronów na cytochrom P450 z NADPH. Elektrony trafiają na NADPH-zależną flawoproteinę (reduktazę cytochromu P450). Reduktaza (CPR) oraz cytochrom stanowią niezależne białka. CPR to przedstawiciel reduktaz diflawinowych (Wiśniewska i in., 2009). Grupami prostetycznymi tego enzymu są kofaktory: FMN (mononukleotyd flawinoadeninowy) oraz FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy). Elektrony pochodzące z NADPH trafiają kolejno na FMN, FAD i zostają przekazane na hem cytochromu P450. Hem przenosi elektron na substrat (RH), ulegając redukcji (Bogacz, 2009). W siateczce śródplazmatycznej komórek wątroby, obok cytochromu P450, znajduje się cytochrom b5, również zawierający hem (Botham i Mayes, 2018). W zależności od formy cytochromu P450, cytochrom b5 może brać udział w przekazywaniu drugiego elektronu (Reed i Holenberg, 2003). Wykazano również, że obecność i stężenie cytochromu b5 ma wpływ na reakcje, które katalizują izoenzymy CYP (Zhang i in., 2008). Drugi system transportu, znajduje się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Elektrony z NADPH trafiają na FAD, który pochodzi z reduktazy flawonoproteinowej. W związku z brakiem FMN, reduktaza mitochondrialna nie może w sposób bezpośredni przenieść elektronów na hem cytochromu P450. Pomocne okazuje się białko żelazo-siarkowe o niewielkich rozmiarach - adrenodoksyna (Bogacz, 2009). To niehemowe białko, przeprowadza transfer elektronu na utleniony cytochrom P450 oraz powoduje jego redukcję (Stryer, 2003). Izoenzymy cytochromu P450 biorą udział w biotransformacji ksenobiotyków tj. leków oraz związków endogennych. Odgrywają kluczową rolę w przemianach toksyn i procesach kancerogenezy (Bogacz, 2009). Enzymy te powodują aktywację oraz inaktywację leków. Zaangażowane są także w metabolizm substancji obcych dla naszego organizmu, dostarczanych np. z pożywieniem. Reakcje I fazy przemian ksenobiotyków, w których biorą udział cytochromy P450 powodują, że powstałe produkty metabolizmu są lepiej rozpuszczalne w wodzie (Szaefer, 2013). Wykazują też zdecydowanie lepszą polarność (Bogacz, 2009). Ułatwia to wydalanie ksenobiotyków z organizmu (Szaefer, 2013). Za przemiany ponad 90% leków odpowiadają wspólnie izoenzymy: CYP2B6, 2C9, 2C19 i 2D6, które należą do rodzin CYP1-3 (Guengerich, 2008). Izoenzymy CYP biorą udział w biotransformacji związków endogennych - kwasów tłuszczowych, steroidów, kwasów żółciowych oraz eikozanoidów (Seliskar i Rozman, 2007). Te ostatnie stanowią produkty przemian dwudziestowęglowego kwasu arachidonowego, z wykorzystaniem epoksygenaz cytochromu P450 (Jawień i Olszanecki, 2017). W biosyntezie steroli i kwasów tłuszczowych, bierze udział kilka izoenzymów CYP. Kluczową rolę odgrywa CYP51A1. Reakcja katalizowana przez ten izoenzym, to 14α-demetylacjalanosterolu. W jej wyniku powstaje cholesterol. Obecność CYP51A1 wykazano w jajnikach, jądrach, wątrobie, nadnerczach i nerkach (Wiśniewska i Mazerska, 2009). Izoenzymy CYP7A1, CYP39A1, CYP7B1 pełnią znaczącą funkcję, w pierwszym etapie biosyntezy kwasów tłuszczowych z oksysterolu i cholesterolu, katalizując reakcję hydroksylacji atomu węgla w pozycji 7 (Wiśniewska, 2008; Wiśniewska i Mazerska, 2009). W syntezie kwasów tłuszczowych bierze udział również CYP8B1, który katalizuje reakcję 12α-hydroksylacji. Izoenzym CYP27A1 jest niezbędny do syntezy oksysteroli i reakcji utlenienia steroli. CYP7B1 bierze udział w alternatywnym szlaku syntezy kwasów tłuszczowych. Katalizuje 7-hydroksylację 27-hydroksycholesterolu oraz kwasu 3β-hydroksy-5-cholestenowego (Wiśniewska, 2008). W przemianę cholesterolu do 24S-hydroksycholesterolu (oksysterolu), zaangażowany jest również CYP46A1, który występuje przede wszystkim w neuronach ośrodkowego układu nerwowego. Oksysterol w przeciwieństwie do cholesterolu, jest bardziej polarny i może swobodnie pokonywać barierę krew-mózg. Wraz z krwiobiegiem, powraca do wątroby i przekształca się w kwasy żółciowe. Może także zostać wydalony z organizmu w postaci glukuronianów i siarczanów. Dzięki tym procesom, możliwe jest wydzielenie cholesterolu z komórek mózgu oraz jego obieg w organizmie. CYP46A1 bierze zatem udział, w utrzymaniu równowagi poziomu cholesterolu, jak również spełnia ważną rolę w hamowaniu rozwoju chorób neurodegeneracyjnych np. choroby Alzheimera (Ohyama, 2006). Wykazano, że obecność, powstałej w wyniku tranzycji T-C intronu drugiego, odmiany polimorficznej CYP46A1, wiąże się z ryzykiem rozwoju choroby Alzheimera (Wiśniewska i Mazerska, 2009). Izoenzymy CYP biorą udział w metabolizmie witaminy D3. CYP27A1 katalizuje, przebiegającą w wątrobie, hydroksylację atomu węgla C-25. Drugim etapem szlaku metabolicznego, zachodzącym w nerkach, jest 1-α-hydroksylacja, katalizowana przez CYP27B1. W wyniku tej reakcji powstaje 1α,25-dihydroksywitamina D3 - aktywna forma wit. D3. Izoenzym CYP24 jest katalizatorem procesu inaktywacji tej formy, stanowi więc razem w CYP27B1 czynnik regulujący stężenie witaminy D3 w surowicy. Izoenzymy rodziny CYP26 - CYP26A1 oraz CYP26B1, występują w wątrobie i zaangażowane są w przemiany kwasu retinowego (pochodna witaminy A). CYP26A1 jest katalizatorem hydroksylacji pochodnych trans tego kwasu (Wiśniewska, 2008). CYP26A1 oraz CYP26B1 nie rozpoznają kwasu cis-retinowego (Wiśniewska i Mazerska, 2009). Enzymy cytochromu P450 katalizują reakcje monooksygenacji. Jednak rodzaj substratu oraz miejsce w cząsteczce, do którego przyłączony zostanie atom tlenu, pozwala enzymom CYP uczestniczyć również w reakcjach: dehydratacji, dehalogenacji, dehydrogenacji, redukcji, izomeryzacji i dimeryzacji. Reakcje utlenienia, które są katalizowane przez te enzymy obejmują reakcje: hydroksylacji, dealkilacji, monooksygenacji heteroatomów i epoksydacji. Hydroksylacja to najbardziej powszechna przemiana, która jest katalizowana przez cytochromy P450 (Bogacz, 2009). Enzymy CYP hydroksylują fenobarbital (pochodna kwasu barbiturowego), powodując zwiększenie jego rozpuszczalności, co za tym idzie ułatwia wydalenie tego związku z organizmu. Hydroksylacji ulegają także wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (Stryer, 2003) . Dealkilacja to reakcja hydroksylacji, która zachodzi w pozycji α w stosunku do heteroatomów. Przykładem jest atom tlenu w eterach lub azot w aminach i amidach. Rozpad wiązania skutkuje O-, S- i N-dealkilacją np. N-dealkilacja imiprapiny (lek o działaniu przeciwdepresyjnym). Monooksygenacja heteroatomów to np. reakcja hydroksylacji wiązania N-H, atomu azotu w aminach lub amidach I- i II-rzędowych. Powstające N- hydroksyloaminy, przekształcają się w I-rzędowe aminy. Te z kolei są metabolizowane do związków nitrozopochodnych (Bogacz, 2009).Reakcje epoksydacji prowadzą do otrzymania epoksydów. To związki reaktywne o właściwościach toksycznych. Ich reakcja z DNA może zapoczątkować procesy kancerogenezy. Przykładem takiego związku jest epoksyd benzo[a]pirenu (Alexandrov i in., 2006). Najprawdopodobniej, niektóre izoenzymy cytochromu P450, w momencie braku odpowiedniego substratu mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (RTF), ulegając autooksydacji. RTF będą uszkadzać zasady purynowe i pirymidynowe, tym samym indukować apoptozę (Bogacz, 2009). Polimorfizm oraz poziom ekspresji genów kodujących enzymy CYP, mają wpływ na zdolność metabolizowania przez te białka biofarmaceutyków i innych substancji chemicznych. Polimorfizm wpływa na strukturę genów izoenzymów cytochromu P450, które są istotne w procesie biotransformacji leków (Niemira i in., 2009). Należą do nich: CYP2A6, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 oraz 3A4. Każdy z tych izoenzymów występuje w kilku odmianach polimorficznych. Wyróżnia się trzy typy pacjentów, w zależności od zdolności metabolizowania leków. Pierwsza grupa to tzw. “przeciętnie metabolizujący”, których forma izoenzymu CYP jest typowa. Osoby ze zmienionym jednym z alleli kodujących enzym CYP, są heterozygotami i określamy je jako „pośrednio metabolizujące”. Pacjenci „słabo metabolizujący” są najczęściej homozygotą recesywną. Charakteryzują się zmniejszoną aktywnością izoenzymu lub nawet jego brakiem. Osoby „bardzo intensywnie metabolizujące” mogą natomiast posiadać więcej niż dwie kopie genu (Weinshilboum, 2003). Enzym CYP2D6 wykazuje aktywność hydroksylazy debryzochiny. Jest najlepiej poznaną izoformą cytochromu P450 (Smolik i in., 2011). Poznano 40 różniących się między sobą odmian polimorficznych tego białka. Oznacza się je symbolami *1 do *43 i obejmują one m.in. 26 alleli, które kodują niefunkcjonalny enzym i 6 alleli, kodujących enzym o niskiej aktywności (Niemira i in., 2009). Takie zróżnicowanie genetyczne CYP2D6, ma swoje konsekwencje, gdyż enzym ten uczestniczy w metabolizmie ok. 25% stosowanych farmaceutyków (Smolik i in., 2011) takich jak: leki antydepresyjne, β-blokery czy opioidy (Niemira i in., 2009). Enzym CYP2D6 kodowany jest przez gen 450 db1, należący do rodziny CYP2D. Znajduje się on na chromosomie 22q13.1. To gen składający się z 9 egzonów, zbudowany z 1491 par zasad, kodujących 497 aminokwasów. Ulega ekspresji w mózgu, wątrobie i jelicie. Zidentyfikowano 196 polimorfizmów pojedynczego nukleotydu enzymu CYP2D6 (Smolik i in., 2011). Nieaktywny enzym CYP2D6 posiada 20% osób należących do kaukaskiej grupy etnicznej oraz ok. 1% reszty populacji. 6% ludzkości nie posiada tego enzymu. Pacjenci słabo metabolizujący, narażeni są na występowanie toksycznych działań niepożądanych stosowanego leku, gdyż zahamowany metabolizm obniża tempo jego wydalania z organizmu. Przykładem są leki antydepresyjne. Farmaceutyki przeciwbólowe, opioidowe i antyarytmiczne, wymagają enzymatycznej aktywacji, stąd brak izoenzymu CYP2D6 obniża również skuteczność tych leków (Niemira i in., 2009). Zauważono powiązanie występowania polimorfizmów w CYP2D6 z predyspozycją do zachorowania na nowotwory i choroby neurologiczne. U osób wolno metabolizujących, stwierdzono zwiększoną zachorowalność na padaczkę i chorobę Parkinsona. Natomiast pacjenci szybko utleniający leki, mogą być bardziej narażeni na nowotwór pęcherza moczowego, jąder, szyjki macicy, płuc czy piersi (Wojtczak i Skrętkowicz, 2009). CYP2C9 metabolizuje ponad sto leków. Znanych jest kilka odmian tego enzymu np. CYP2C9*2, CYP2C9*3, różniące się jednym aminokwasem, które występują u około 20% całej populacji kaukaskiej oraz u 2-3% w azjatyckiej grupie etnicznej. Ich obecność powoduje obniżenie metabolizmu leków: antykoagulacyjnych (acenokumarol, warfaryna), niesteroidowych leków przeciwzapalnych (diklofenak, ibuprofen) i leków przeciwpadaczkowych (fenytoina). Pacjenci posiadający wersję genu CYP2C9*3, charakteryzują się bardzo słabą zdolnością metabolizowania warfaryny, która obniża krzepliwość krwi. U takich osób, lek występuje we krwi w wysokim stężeniu. Stwarza to zagrożenie krwotoku wewnętrznego. Z kolei pacjenci z wersjami CYP2C9*2 i CYPC9*3, narażeni są na zwiększone stężenie fenytoiny we krwi, co jest toksyczne dla układu nerwowego. W obu tych przypadkach konieczne jest zastosowanie zmniejszonej dawki leku (Niemira i in., 2009). CYP2C19 metabolizuje niewielką liczbę leków (Niedzielska i in., 2007). Odmiany polimorficzne tego izoenzymu zostały odkryte podczas badań przemian mefenytoiny, którą stosuje się w leczeniu padaczki. Zdecydowanie więcej osób słabo metabolizujących występuje w Azji, niż w kaukaskiej grupie etnicznej. Poznano około 15 alleli genu kodującego CYP2C19, z czego sześć (CYP2C19*2 do CYP2C19*8) kodują nieaktywny enzym. Najczęściej występujące allele to: CYP2C19*2 (posiada mutację w 5 egzonie) oraz CYP2C19*3 (zawiera kodon „stop”) (Niemira i in., 2009). Te dwa warianty powstają na skutek zmiany pojedynczego nukleotydu. Polimorfizm genu kodującego izoenzym CYP2C19, może skutkować skróceniem łańcuchów polipeptydowych, powstaniem przedwczesnych kodonów stop lub pozbawieniem aktywności enzymu (Niedzielska i in., 2007). Lek metabolizowany przez enzym CYP2C19 to omeprazol, który jest inhibitorem pompy protonowej. Jego zadaniem jest zmniejszenie wydzielania kwasów żołądkowych. Terapia ta stosowana jest m.in. w leczeniu wrzodów żołądka. Jednak u pacjentów słabo utleniających lek, stwierdzono wzrost stężenia protonów (Mathijssen i van Schaik, 2006). Izoenzym CYP3A4 to jeden z najważniejszych enzymów cytochromu P450 komórek wątroby i jelita cienkiego. Aktywność tego enzymu wykazano również w żołądku, płucach i jelicie grubym oraz niektórych komórkach nowotworowych. To kluczowy enzym biorący udział w przemianach metabolicznych wielu związków endogennych oraz leków. Gen kodujący CYP3A4 znajduje się na 7 chromosomie (7q22.1) (Wiśniewska i Mazerska, 2009). Poznano około 40 alleli tego genu. CYP3A4*1B jest najbardziej powszechną odmianą polimorficzną (Niemira i in., 2009). Leki, które posiadają w swojej budowie ugrupowania o charakterze lipofilnym są najczęstszymi substratami CYP3A4. Należą do nich antybiotyki (cyklosporyna, erytromycyna), leki psychotropowe (triazolam, midazolam), leki przeciwnowotworowe (ifosfamid, cyklofosfamid i inne) oraz leki stosowane w schorzeniach układu krążenia (diltiazem, nifedypina). Reakcje metabolizujące wyżej wymienione grupy leków to głównie: hydroksylacja, której ulegają grupy benzylowe oraz alifatyczne fragmenty cząsteczki, oksydacyjna N-dealkilacja, zachodząca w erytromycynie, lidokainie i N-dehalogenacja. Związki przeciwnowotworowe takie jak cyklofosfamid, ulegają specyficznej 4-hydroksylacji. Spośród związków endogennych (kortyzol, testosteron, estradiol, progesteron) podstawową reakcją katalizowaną przez CYP3A4 jest 6β-hydroksylacja testosteronu. Związki metabolizowane przez ten izoenzym charakteryzują się obecnością łańcuchów lub pierścieni węglowodorowych, posiadających właściwości lipofilowe oraz grup aminowych i hydroksylowych o charakterze polarnym. Konsekwencją oddziaływań hydrofobowych, między izoenzymem a substratem jest ich wzajemne związanie. Ta reakcja wymaga jednak usunięcia cząsteczek wody z centrum aktywnego enzymu. (Wiśniewska i Mazerska, 2009). CYP3A4*1B występuje u ponad 50% całej populacji Afroamerykanów i u 5% populacji kaukaskiej, nie zaobserwowano obecności tego genu u Azjatów. Znaczenie występowania mutacji w obrębie izoenzymu CYP3A4 nie jest do końca wyjaśnione. Okazuje się, że większość reakcji metabolizowanych przez prawidłowy i zmutowany enzym CYP3A4, w tym metabolizm progesteronu i testosteronu, zachodzi w podobny sposób. Wyjątek stanowi zmiana w procesie metabolizowania testosteronu w obecności CYP3A4*17 oraz CYP3A4*18. Nie stwierdzono więc, czy mutacje izoenzymu CYP3A4, mają wpływ na przebieg procesów transformacji leków, katalizowanych przez to białko. Uważa się, że polimorfizmy izoenzymu CYP3A4 nie są istotne w przemianach leków oraz wydalaniu ich z organizmu (Niemira i in., 2009). CYP2B6 jest jednym z głównych enzymów katalizujących transformację leków przeciwnowotworowych. Gen kodujący ten izoenzym, posiada 25 różnych alleli. Aktywność CYP2B6 wykazuje związek z płcią. Obniżoną aktywność tego białka, w reakcji N-demetylacji S-mefenytoiny, można zauważyć u 20% mężczyzn i 7 % kobiet (Mathijssen i van Schaik, 2006). Izoforma CYP2B6*6 katalizuje reakcję 4-hydroksylacji cyklofosfamidu (lek przeciwnowotworowy), jak również bierze udział w transformacji leku - efawirenz - stosowanego podczas terapii pacjentów chorych na HIV. CYP1A2 metabolizuje związki kancerogenne. U osób intensywnie metabolizujących, podwyższony poziom tego izoenzymu, powoduje zwiększenie stężenia we krwi metabolitów: policyklicznych węglowodorów aromatycznych (benzopiren), amin heterocyklicznych, pochodzących z żywności lub mykotoksyn (aflatoksyna) (Niemira i in., 2009). Wykazano, że kontrola ekspresji enzymów CYP, odbywa się na poziomie transkrypcji. Substancje egzogenne wpływają na aktywność receptorów jako ligandy, które aktywują czynniki transkrypcyjne (Bogacz, 2009). Do takich czynników należą białka z rodziny bHLH-PAS, jak również receptory jądrowe, do których zaliczamy NHR - hormonalne receptory jądrowe. Ahr (receptor węglowodorów aromatycznych) jest przedstawicielem bHLH-PAS. Ahr aktywowany jest przez wielopierścieniowe związki organiczne, takie jak dioksyny i ich pochodne (Niemira i in., 2009). Receptory NHR podzielono na trzy klasy. Klasę I stanowią receptory steroidowe: progesteronowy, estrogenowy, androgenowy, glukokortykoidowy oraz mineralokortykoidowy. Do II klasy receptorów NHR zaliczamy: receptor tyroidowy, receptor kwasu retinolowego oraz receptor witaminy D. Klasa III to tzw. receptory „sieroce” (receptory, dla których początkowo nie znano ligandu) (Bain i in., 2007). Zaliczamy tutaj: CAR - konstytutywny receptor androstanu, PXR - receptor pregnanu, PPAR - receptor, który jest aktywowany przez proliferatory peroksysomów, LXR - wątrobowy receptor X, FXR - receptor kwasów żółciowych oraz RXR - receptor retinoidowy. Wyżej wymienione czynniki, określa się jako receptory ksenobiotyków (XR), gdyż właśnie od nich zależy aktywność biologiczna związków egzogennych(Niemira i in., 2009). Receptor Ahr powoduje hamowanie ekspresji enzymów z podrodziny CYP1A1, A2 oraz B1, a także wybranych genów kodujących w II fazie metabolizmu ksenobiotyków. Dioksyny stanowiące ligandy receptorów Ahr, posiadają właściwości toksyczne i mogą być odpowiedzialne za większe uszkodzenia DNA u osób z podwyższonym poziomem CYP1A. Czynniki CAR i PXR biorą udział w regulacji ekspresji genów, kodujących izoenzymy głównie podrodziny CYP3A, które to odpowiadają za metabolizm leków (Bogacz, 2009). Receptory NHR na swoim C-końcu zawierają: domenę wiążącą ligand (LBD), domenę wiążącą DNA (DBD), domeny, które aktywują transkrypcję (AF-1 i AF-2) oraz centralną domenę typu „zawias” (Monostory i Pascussi, 2008). Domena DBD zbudowana jest z dwóch palców cynkowych, które umożliwiają rozpoznanie sekwencji, jak również związanie się białka w miejscu regulatorowym

Created on Aug 30, 2019

Farmakogenetyka (Pages)

Wykazują często niewielką specyficzność substratową. Mogą zatem brać udział w metabolizmie związków, charakteryzujących się różnorodną budową chemiczną. Enzymy metaboliczne zaangażowane są w biotransformację ksenobiotyków, jak również w procesy przemian związków endogennych (np. hormonów steroidowych, hemu, kwasów żółciowych). Oprócz wyżej wymienionych enzymów również flora bakteryjna jelit ma wpływ na biotransformację, szczególnie na procesy hydrolizy i redukcji (Mutschler, 2010). Biotransformacja jest procesem etapowym, podzielonym na trzy fazy. W fazie I do cząsteczki leku zostaje wprowadzona polarna grupa funkcyjna lub następuje modyfikacja już istniejącej grupy, która powoduje zwiększenie jej polarności (Graham, 2004). Lek w tej fazie może ulegać utlenieniu, redukcji i hydrolizie. Reakcje utleniania są szczególnie ważne w procesie metabolizowania leków. Biorą w nich udział oksygenazy, dioksygenazy i monooksygenazy (Kubowicz - Kwaśny, 2016). Oksydazy odłączają od cząsteczki leku wodór lub elektrony (Mutschler, 2016). Monooksygenazy wbudowują jeden z atomów tlenu w obcy związek, drugi atom ulega redukcji i przy udziale NAD(P)H wytwarza cząsteczkę wody (Kubowicz -Kwaśny, 2016). Dioksygenazy wprowadzają do leku obydwa atomy tlenu (Mutschler, 2016). Największe znaczenie w I fazie biotransformacji leków mają monooksygenazy, o typie cytochromu P450 (CYP450). Substrat L-H wiąże się z trójwartościowym żelazem, znajdującym się w centrum aktywnym CYP450. Żelazo ulega redukcji i wykazuje drugi stopień utlenienia a NADPH ulega utlenieniu. Następuje związanie tlenu cząsteczkowego oraz przyjęcie kolejnego elektronu. W następstwie, powstaje trzeciorzędowy kompleks. Ulega on rozpadowi do hydroksylowanego substratu. Reakcja przebiega następująco:L-H + O2 + NADPH + H+ => L-OH + H2O + NADP+ gdzie, L - lek. Innym rodzajem enzymów, które zaangażowane są w utlenianie leków są monooksygenazy flawinowe (FMO). Pozostałe enzymy utleniające to: oksydaza aldehydowa, dehydrogenaza alkoholowa, i monoaminooksydaza (MAO). Procesy redukcji odgrywają podrzędną rolę w biotransformacji leków, przykładem jest chloramfenikol (lek przeciwbakteryjny), który zostaje częściowo metabolizowany przez nitroreduktazę obecną w wątrobie. Reakcje redukcji dotyczą szczególnie grup nitrylowych oraz azotowych i powodują powstanie odpowiednich amin. Kolejną, ważną reakcją I fazy jest hydroliza zachodząca przy udziale amidazy, epoksydohydratazy, glukuronidazy, glikozydazy i esterazy oraz dekarboksylacja m.in. w przypadku aminokwasów (Kubowicz-Kwaśny, 2016). Faza II opiera się na reakcjach sprzężenia (koniugacji). Powstała we wcześniejszej fazie, cząsteczka polarna, ulega sprzężeniu z określoną grupą funkcyjną cząsteczki leku (Graham, 2004). W reakcjach koniugacji, biorą udział specyficzne transferazy. Do ważniejszych reakcji II fazy należy sprzęganie z: aktywowanym siarczanem, aktywowanym kwasem glukuronowym, aminokwasami (szczególnie z glicyną), aktywowanym kwasem octowym, oligopeptydami i S-adenozylometioniną. W reakcjach tych (oprócz procesów metylacji i sprzęgania z kwasem octowym), do cząsteczki zostaje wprowadzona grupa kwasowa, która zwiększy jej hydrofilność i rozpuszczalność. Reakcje sprzęgania posiadają charakter dezaktywacji (pozbawiają aktywności biologicznej) oraz detoksykacji, stąd związki powstałe w II fazie, są najczęściej nieczynne biologicznie (Mutschler, 2010). Reakcje koniugacji wymagają dostarczenia energii w postaci ATP (adenozyno 5’-trifosforan). Dodatkowo, wyróżnia się III fazę. Podczas tych reakcji następuje m.in. czynny, przezbłonowy transportu leków do wnętrza jelita. Budowa danego leku warunkuje jego reakcje na zmiany metaboliczne. Grupy N-metylowe, mogą ulegać metylacji, pierścienie aromatyczne utleniać się do fenoli, amidy i estry ulegać hydrolizie (Graham, 2004). Biotransformacja może prowadzić do powstania: proleków, metabolitów nieaktywnych, metabolitów o właściwościach toksycznych oraz metabolitów o innym działaniu (Kubowicz-Kwaśny, 2016). Na efekt farmakologiczny ma wpływ zmienność genetyczna występująca w genach, głównie kodujących enzymy metabolizujące leki, transportery leków, jak również związanych z działaniem leków (Ingelman-Sundberg i Rodriguez-Antona, 2005). Jednym z najważniejszych enzymów II fazy, który wykazuje istotny, pod względem klinicznym i funkcjonalnym polimorfizm, jest glukuronozylotransferaza difosforanu urydyny (UGT) (Li i Bluth, 2011). UGT-glukuronylotransferazy podobnie jak cytochromy P450, biorą udział w szlakach metabolicznych związków endogennych oraz ksenobiotyków. Mimo odmiennych zdolności katalitycznych, oba białka są silnie zakotwiczone w błonach siateczki śródplazmatycznej. UGT charakteryzują się również szeroką specyficznością substratową, dzięki czemu mogą katalizować szeroką gamę reakcji, polegających na transformacji egzo- i endogennych związków hydrofobowych. Izoenzymy UGT katalizują reakcję sprzęgania grupy glikozylowej kwasu urydyno-5’-difosforo-D-glukuronowego (UDPGA) z aglikonem. UDPGA zostaje przyłączony do określonej grupy funkcyjnej metabolitu fazy I. Dzięki temu polarność aglikonu zwiększa się. Związek ten może zostać wydalony z komórki, co w konsekwencji obniża jego toksyczność. Reakcja koniugacji z kwasem glukuronowym, uważana jest za podstawę detoksykacji (Fedejko i Mazerska, 2011). Reakcja glukuronidacji polega na przeniesieniu kwasu α–D-glukuronowego z UDPGA na grupę funkcyjną cząsteczki leku. Związek, który ulega reakcji z UDPGA, musi zawierać określoną grupę funkcyjną: tiolową, hydroksylową aminową, karboksylową lub sulfonamidową (Fedejko i Mazerska, 2011; Li i Bluth, 2011). U człowieka, znanych jest 19 UGT-glukuronylotransferaz, które kodowane są przez dwie rodziny genów: UGT1 oraz UGT2. Ze względu na podobieństwo sekwencji, rodziny te podzielono na 3 podrodziny: UGT1A, UGT2A oraz UGT2B (Fedejko i Mazerska, 2011). Polimorfizmy genetyczne wykryto dla prawie wszystkich genów rodziny UGT. Zmienności te, wpływają na ekspresję i funkcję danego białka. Mogą również modyfikować zdolność glukuronidacji enzymu w stosunku do substancji rakotwórczych, związków endogennych lub leków. Polimorfizmy genów UGT mogą przyczyniać się do podatności organizmu na choroby, w tym nowotwory, wpływają również na farmakokinetykę (zmianę stężenia leku w czasie) oraz kliniczne efekty działania leku. Do najważniejszych przykładów należą allele obniżające aktywność promotora UGT1A1 (np. UGT1A1*6, UGT1A1*28), które związane są ze zmniejszoną glukuronidacją aktywnego metabolitu irynotekanu (SN-38) co skutkuje, zwiększonym ryzykiem toksyczności, wywołanej przez irynotekan (lek przeciwnowotworowy) (Li i Bluth, 2011). Glikoproteina P (P-gp) to błonowy transporter, który należy do nadrodziny białek ABC. P-gp określana jest, jako białko oporności wielolekowej (ang. multidrug resistance protein 1- MDR-1). Działa jak pompa zależna od ATP i usuwa do środowiska zewnętrznego egzogenne i endogenne cząsteczki hydrofobowe, w tym również ksenobiotyki. P-gp wykazuje szeroką specyficzność substratową. Rozpoznaje związki o masie cząsteczkowej od 330 do 4000 Da, charakteryzujące się różnorodną budową chemiczną. Transportuje substancje obojętne oraz kationy, nie przenosi anionów (Sokołowska i in., 2014). Glikoproteiny P transportujące leki znajdują się w wątrobie, jelicie, nerkach mózgu, łożysku, czyli narządach istotnych dla zaopatrzenia i eliminacji farmaceutyków z organizmu (Panczyk i in.,2007). Poziom Glikoproteiny P w komórce zależy od czynników środowiskowych, jak również od zmienności obecnych w genie MDR1, który koduje to białko. Niezrównoważone sprzężenie (LD) pomiędzy polimorfizmami pojedynczych nukleotydów genu MDR1, jest wynikiem współdziedziczenia SNP w obrębie jednego haplotypu. Polimorfizm genu MDR1 może wpływać na biodostępność leków, które są substratami MDR1 i decydować o skuteczności farmakoterapii. Opisano ponad 50 SNP i trzy polimorfizmy indel w genie MDR1 u ludzi. Jednak tylko cicha mutacja w 26 egzonie w pozycji C3435T, ma wpływ na zmianę ekspresji glikoproteiny P. Badania udowodniły, że występuje związek pomiędzy tym SNP a zmianą w funkcjonowaniu P-gp (Sokołowska i in., 2014). Postawiono kilka hipotez, które opisują wpływ cichego polimorfizmu w pozycji C3435T na fenotyp. Najbardziej właściwa wydaje się być ta, mówiąca o istnieniu LD pomiędzy C1236T i C3435T (tzw. ciche polimorfizmy) a SNP w pozycji G2677T/A. Te trzy SNP współdziedziczą się zatem w obrębie jednego haplotypu. Analiza haplotypowa umożliwia dokładniejszą ocenę wpływu SNP określonego haplobloku i ma istotne znaczenie, w przewidywaniu farmakokinetyki substratów glikoproteiny P - cyklosporyny i digoksyny (Panczyk i in.,2007). Badania farmakogenetyczne mają na celu określenie czynników genetycznych, które mają wpływ na metabolizm farmaceutyków oraz mogą być związane z wystąpieniem skutków ubocznych. Farmakogenetyka obejmuje różnice w budowie DNA (genotyp), jak również różnice w reakcji na lek (fenotyp). Do najczęściej stosowanych metod badań farmakogenetycznych

Created on Aug 30, 2019

Zmienność w ludzkim genomie (Pages)

Autor: Katarzyna Nabielec International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) podaje, że genom człowieka zawiera 3,08 mld nukleotydów (Słomski, 2008). Ich ułożenie w sekwencję to informacja genetyczna, która stanowi wspólną cechę genomów wszystkich ludzi. Jednakże, każdy genom ludzki posiada charakterystyczny dla siebie zbiór różnic, zwanych zmiennością. Porównanie ich w obrębie

Created on Aug 30, 2019

Czy jest coś, czego nie potrafi CRISPR? (Pages)

choroby dziedziczne. Być może jest to najbardziej ekscytujące zastosowanie dla CRISPR, ale daje również dużo do myślenia i budzi kontrowersje. Granica pomiędzy terapią (leczeniem chorób) a poprawianiem (samodoskonaleniem na podobieństwo chirurgii plastycznej)

Created on May 08, 2019

Amerykanie szukają inwestycji w Polsce. Stawiają na innowacje (News)

Inwestorzy z USA chcą budować innowacyjne startupy biotechnologiczne w Polsce. W maju do Łodzi przyjadą przedstawiciele firm m.in ze Stanów Zjednoczonych

Created on May 06, 2019

Ogólnopolska Konferencja Doktorantów Nauk o Życiu BioOpen 2019 (Pages)

młodych naukowców, którzy prowadzą badania w zakresie dyscyplin, określanych jako nauki o życiu. W tym roku w dniach 30-31 maja w budynku D Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska UŁ mieszczącego się przy ul. Pomorskiej 141/143 w Łodzi odbędzie się już piąta edycja

Created on Apr 19, 2019

Page 1 / 50 (1 - 10 of 491 Total)

Start a new search