Autor: Paulina Radwańska, Katarzyna Witkowska, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Katedra Przedklinicznych Nauk Weterynaryjnych, Zakład Patofizjologii, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
Termin „mikrobiom” został zaproponowany w 2001 r. przez Joshua Lederberg’a dla określenia całej populacji komensalnych, symbiotycznych i chorobotwórczych mikroorganizmów (17). Jednak obecnie termin ten stosuje się w odniesieniu do wszystkich genomów mikroorganizmów bytujących w organizmie człowieka. Badaniem mikrobiomu zajmuje się metagenomika (genomika populacyjna drobnoustrojów środowiskowych). Jest to dziedzina nauki, która w oparciu o metody sekwencjonowania materiału genetycznego pozyskiwanego bezpośrednio ze środowiska oraz porównawcze metody analityczne, umożliwia poznanie genomu mikroorganizmów bez konieczności ich izolacji i hodowli. Metagenomika obejmuje izolację DNA mikroorganizmów bezpośrednio z próbek pobieranych z naturalnego środowiska flory bakteryjnej, dezintegrację błon komórkowych bakterii w celu uwolnienia ich zawartości przy zastosowaniu zarówno metod chemicznych (np. umieszczenie komórek w roztworze zasadowym), jak i fizycznych (np. sonifikacja), klonowanie in vitro fragmentów restrykcyjnych lub produktów PCR obejmujących fragment genu, całą sekwencję genu lub sekwencję regulatorową, poprzez ich trwałe połączenie za pomocą ligazy DNA z samoreplikującą się cząsteczką DNA, najczęściej wyizolowanym uprzednio wektorem plazmidowym, transformację klonów komórek kompetentnych, konstrukcję biblioteki klonów, analizę genetyczną i funkcjonalną biblioteki oraz selekcję klonów o określonych genotypach czy właściwościach biologicznych. Umożliwia identyfikację i charakterystykę bakterii na poziomie genotypów oraz fenotypów, dokładne badania poznawcze w dziedzinie taksonomii i filogenezy bakterii w różnorodnych środowiskach naturalnych, analizę właściwości biologicznych opierając je na odczytywaniu informacji genetycznej klonowanych genomów oraz genów, a także identyfikację bioproduktów syntetyzowanych przez dotąd niepoznane bakterie. Pozwala także na poznanie zależności pomiędzy zmianami w mikrobiomie a rozwojem chorób u ludzi (5,10,20,21).
Rola mikroflory jelit w indukcji choroby Leśniowskiego-Crohna
Choroba Leśniowskiego-Crohna (ChL-C) należy do przewlekłych idiopatycznych chorób zapalnych, które mogą dotyczyć każdego odcinka przewodu pokarmowego. Najczęstszą lokalizacją zmian zapalnych jest końcowy odcinek jelita krętego (40-50% wszystkich przypadków). Chorobie towarzyszą objawy ze strony przewodu pokarmowego (bóle brzucha, przewlekła biegunka z domieszką śluzu, krwi lub treści ropnej, przetoki i ropnie okołoodbytnicze), objawy ogólnoustrojowe (gorączka, utrata masy ciała), jak również objawy ze strony określonych układów (m.in. bóle i zapalenia stawów, aftowe zapalenie błony śluzowej jamy ustnej, piodermia zgorzelinowa, rumień guzowaty, kamica nerkowa, osteopenia, stłuszczenie wątroby, kamica pęcherza żółciowego, zapalenie nadtwardówki, tęczówki oraz błony naczyniowej). Jednym ze zjawisk towarzyszących ChL-C jest dysbioza czyli zmiana w składzie mikroflory jelit związana m.in. ze zmniejszeniem jej różnorodności. Dotyczy to zarówno mikroorganizmów fekalnych, jak i związanych ze śluzówką, tworzących biofilm. Zmiany dysbiotyczne charakterystyczne dla ChL-C dotyczą wzrostu tempa proliferacji bakterii silne wzbudzających odpowiedź immunologiczną, a spadku liczby bakterii o właściwościach przeciwzapalnych (12,14,16). Wiadomo, iż w przebiegu choroby Leśniowskiego-Crohna stwierdza się znaczne zmniejszenie liczby Gram-dodatnich bakterii typu Firmicutes o właściwościach protekcyjnych i przeciwzapalnych (Clostridium leptum, Clostridium coccoides, Faecalibacterium prausnitzii) (2,16). Bakterie te produkują duże ilości maślanu, który jest źródłem energii dla kolonocytów, wzmacnia ścisłe połączenia między komórkami nabłonka, poprawia stan bariery śluzówkowej oraz wykazuje bezpośrednie przeciwzapalne działanie w obrębie błony śluzowej jelit poprzez obniżenie stężenia cytokin prozapalnych (IL-6, IL-8, TNF-α) (1,4). W przebiegu choroby Leśniowskiego-Crohna dochodzi także do wzrostu liczby drobnoustrojów typu Bacteroidetes (np. Bacteroides vulgatus), obejmujących bakterie Gram-ujemne, które ze względu na obecność lipopolisacharydu silniej oddziałują na układ immunologiczny (2). Rozwój choroby Leśniowskiego-Crohna może być także związany z występowaniem adherentno – inwazyjnych szczepów E.coli (AIEC). W przebiegu ChL-C wykazano znacznie podwyższony poziom przeciwciał przeciwko flagelinie bakterii gatunku Escherichia col. Szczepy AIEC E. coli w warstwie podśluzówkowej jelit dokonują inwazji makrofagów, co prowadzi do zaburzonej sekrecji TNF-α, zwiększonego wydzielania cytokiny prozapalnej IL-23 i zmniejszonej produkcji cytokiny przeciwzapalnej IL-10 (6,8,14,22).
Mikroflora jelit a otyłość
Wyniki badań z ostatnich lat, wskazują także na związek pomiędzy mikroflorą jelit a rozwojem otyłości. Wiadomo, że bakterie jelitowe uczestniczą w dojrzewaniu i wymianie enterocytów, immunomodulacji, aktywności motorycznej przewodu pokarmowego, metabolizmie leków, rozkładaniu obecnych w pożywieniu toksyn i karcynogenów (np. heterocykliczne aminy, związki N-nitrozowe), fermentowaniu niestrawionych składników pożywienia, w produkcji niezbędnych witamin (K, B12, kwas foliowy, B1, B6), w recyrkulacji kwasów żółciowych (poprzez wytwarzanie hydrolaz kwasów żółciowych), a także w ochronie przed kolonizacją jelit przez bakterie patogenne, takie jak Escherichia coli, Vibrio cholerae, Clostridium spp., Salmonella spp., Shigella spp. (7,11,15,20,23). Turnbaugh i współaut. (24) udowodnili, że skład mikroflory jelitowej wpływa na masę ciała. Przeprowadzili transfer mikroorganizmów z jelit homozygotycznych myszy otyłych ob/ob. (myszy z genetycznie uwarunkowanym brakiem leptyny wynikającym z mutacji typu nonsens w 105 kodonie genu ob.) i myszy o prawidłowej masie ciała do jelit myszy „germ free” (wolne od wszystkich wykrywalnych mikroorganizmów i pasożytów) o prawidłowej masie ciała. Po dwóch tygodniach zaobserwowano, że myszy, którym przeszczepiono mikroflorę od myszy otyłych, pozyskiwały więcej kalorii z pożywienia i wykazywały szybsze odkładanie tkanki tłuszczowej. Ponadto wiadomo, że flora bakteryjna otyłych ludzi oraz myszy zawiera mniej bakterii typu Bacteroidetes i odpowiednio więcej Firmicutes, niż flora osobników szczupłych. Bakterie typu Firmicutes łatwiej niż Bacteroidetes metabolizują składniki żywności i skuteczniej pozyskiwana jest dodatkowa energia, co może być jedną z przyczyn otyłości (11,18,19). Ponadto, w badaniach przeprowadzonych na myszach wykazano, iż dieta bogata w tłuszcze zwiększa endotoksemię, redukuje liczbę bakterii Gram-ujemnych (Bacteroides spp.), Gram-dodatnich (Eubacterium recitale), indukuje rozwój otyłości, powstawanie insulinoopornści i cukrzycy (9). Jednak wyjaśnienie zależności pomiędzy przyrostem masy ciała a florą bakteryjną jelit wymaga dalszych badań.
Mikroflora jelit a choroby nowotworowe
Szacuje się, że około 15% chorób nowotworowych wzbudzanych jest przez infekcje bakteryjne. Wiadomo, że niektóre komensalne bakterie mogą przekształcać prokarcynogeny w związki uszkadzające DNA (np. etanol, heterocykliczne aminy) lub bezpośrednio wytwarzać karcynogeny (np. fecapentaenes), jak również stymulować wytwarzanie wolnych rodników tlenowych (np. Enterococcus faecalis), przez co rośnie ryzyko rozwoju raka jelita grubego (CRC – colorectal cancer) (20). Wykazano, że myszy „germ free”, nieprodukujące Il-10 czy transformującego czynnika wzrostu β1 (TGF-β1) są mniej podatne na rozwój nieswoistego zapalenia jelit (IBD – inflammatory bowel disease), a także raka jelita grubego. Myszy po kolonizacji jelit przez normalną mikroflorę są natomiast bardziej narażone na rozwój IBD oraz CRC (13,25). Jednak, z drugiej strony flora bakteryjna może produkować maślan, który jest silnym inhibitorem deacetylazy histonów i w związku z tym może powodować epigenetyczne programowanie kolonocytów oraz uczestniczyć w mechanizmach obronnych przed nowotworami jelit (3,20).
Literatura:
Andoh A, Bamba T, Sasaki M. Physiological and anti-inflammatory roles of dietary fiber and butyrate in intestinal functions. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition 1999;23:S70-S73.
Andoh A, Imaeda H, Aomatsu T, Inatomi O, Bamba S, Sasaki M, Saito Y, Tsujikawa T, Fujiyama Y. Comparison of the fecal microbiota profiles between ulcerative colitis and Crohn’s disease using terminal restriction fragment length polymorphism analysis. Journal of Gastroenterology 2011;46:479-486.
Balamurugan R, Rajendiran E, George S, Samuel GV, Ramakrishna BS. Real-time polymerase chain reaction quantification of specific butyrate-producing bacteria, Desulfovibrio and Enterococcus faecalis in the feces of patients with colorectal cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology 2008;23:1298-1303.
Banasiewicz T, Borycka-Kiciak K, Dobrowolska-Zachwieja A, Friediger J, Kiciak A, Krokowicz P, Małecka-Panas E, Pietrzak P, Rydzewska G, Tarnowski W, Zabielski R. Kliniczne aspekty zastosowania kwasu masłowego w postępowaniu dietetycznym w chorobach jelit. Przegląd Gastroenterologiczny 2010;5:329-334.
Binek M. Mikrobiom człowieka – zdrowie i choroba. Postępy Mikrobiologii 2012;51:27-36.
Bringer MA, Glasser AL, Tung CH, Méresse S, Darfeuille-Michaud A. The Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli strain LF82 replicates in mature phagolysosomes within J774 macrophages. Cellular Microbiology 2006;8:471-484.
Buda B, Dylus E, Górska-Frączek S, Brzozowska E, Gamian A. Właściwości biologiczne białek powierzchniowych bakterii z rodzaju Lactobacillus. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej 2013;67:229-237.
Campos N, Magro F, Castro AR, Cabral J, Rodrigues P, Silva R, Appelberg R, Rodrigues S, Lopes S, Macedo G, Sarmento A. Macrophages from IBD patients exhibit defective tumour necrosis factor-α secretion but otherwise normal or augmented pro-inflammatory responses to infection. Immunobiology 2011;216:961-970.
Cani PD, Amar J, Iglesias MA, Poggi M, Knauf C, Bastelica D, Neyrinck AM, Fava F, Tuohy KM, Chabo C, Waget A, Delmée E, Cousin B, Sulpice T, Chamontin B, Ferrières J, Tanti JF, Gibson GR, Casteilla L, Delzenne NM, Alessi MC, Burcelin R. Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance. Diabetes 2007;56:1761-1772.
Czuba K. Metagenomika – nowa strategia identyfikacji mikroorganizmów. http://laboratoria.net/artykul/21071.html.
DiBaise JK, Zhang H, Crowell MD, Krajmalnik-Brown R, Decker GA, Rittmann BE. Gut microbiota and its possible relationship with obesity. Mayo Clinic Proceedings. 2008;83:460-469.
Dobrowolska-Zachwieja A, Kaczmarek M, Hoppe-Gołębiewska J, Kalak R, Słomski R, Linke K. Wpływ wariantu mutacji NOD2/CARD15 na występowanie objawów spoza przewodu pokarmowego u chorych z chorobą Leśniowskiego-Crohna w populacji polskiej. Nowiny Lekarskie 2004;73:337-348.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, Boivin GP, Croft J, Balish E, Doetschman T. Elimination of colon cancer in germ-free transforming growth factor beta 1-deficient mice. Cancer Research 2002;62:6362–6366.
Franczuk A, Jagusztyn-Krynicka EK. Rola mikroflory jelit w indukcji choroby Leśniewskiego-Crohna w świetle programu badań Human Microbiome Project. Postępy Mikrobiologii 2012;51:257-264.
Hsiao A, Ahmed AMS, Subramanian S, Griffin NW, Drewry LL, Petri WA Jr, Haque R, Ahmed T, Gordon JI. Members of the human gut microbiota involved in recovery from Vibrio cholerae infection. Nature 2014;515:423-426.
Joossens M, Huys G, Cnockaert M, De Preter V, Verbeke K, Rutgeerts P, Vandamme P, Vermeire S. Dysbiosis of the faecal microbiota in patients with Crohn’s disease and their unaffected relatives. Gut 2011;60:631-637.
Lederberg J, McCray AT. ‘Ome sweet’ omics – A genealogical treasury of words. The Scientist 2001;15:8.
Ley RE, Bäckhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, Gordon JI. Obesity alters gut microbial ecology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2005;102:11070-11075.
Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature 2006;444:1022-1023.
Olszewska J, Jagusztyn-Krynicka EK. Human Microbiome Project – Mikroflora jelit oraz jej wpływ na fizjologię i zdrowie człowieka. Postępy Mikrobiologii 2012;51:243-256.
Schloss PD, Handelsman J. Biotechnological prospects from metagenomics. Current Opinion in Biotechnology 2003;14:303-310.
Sitaraman SV, Klapproth JM, Moore DA 3rd, Landers C, Targan S, Williams IR, Gewirtz AT. Elevated flagellin-specific immunoglobulins in Crohn’s disease. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology 2005;288:G403-G406.
Strzępa A, Szczepanik M. Wpływ naturalnej flory jelitowej na odpowiedź immunologiczną. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej 2013;67:908-920.
Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, Magrini V, Mardis ER, Gordon JI. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 2006;444:1027-1031.
Uronis JM, Mühlbauer M, Herfarth HH, Rubinas TC, Jones GS, Jobin C. Modulation of the intestinal microbiota alters colitis-associated colorectal cancer susceptibility. PLoS One 2009;4:e6026.
