Pojęcie terapii genowej narodziło się w roku 1962 podczas prac prowadzonych przez Elizabeth i Wacława Szybalskich na Uniwersytecie Wisconsin. Wprowadzili oni fragmenty genomowego DNA do ludzkich komórek szpiku za pomocą roztworu fosforanu wapnia. Terapia genowa jest jedną z metod leczenia osób ze zdiagnozowaną chorobą dziedziczną. Nie jest to rodzaj jedynie leczenia objawowego, genoterapia usuwa bowiem źródło problemu. Polega na terapeutycznym wykorzystaniu zarówno genów jak i krótszych, nie kodujących sekwencji DNA lub RNA. Naprawę wady genetycznej uzyskuje się przez wprowadzenie do wnętrza komórki prawidłowej postaci zmutowanego genu w celu uzyskania jego ekspresji bądź też modyfikację aktywności poszczególnych genów. W tym drugim przypadku wprowadza się do komórki dodatkowe kopie tych genów, które nie funkcjonują wydajnie w celu wzmocnienia ich działania. Możliwe jest również zahamowanie aktywności genów wykazujących nadmierną ekspresję, także z użyciem nie kodujących sekwencji DNA lub RNA.
Metody wprowadzania kwasów nukleinowych do komórki
Geny można wprowadzać do komórek pobranych z organizmu (ex vivo), które są następnie dostarczane do pacjenta z powrotem. W ten sposób dokonywane są manipulacje na komórkach szpiku i krwi. Czasem konieczne jest namnożenie pobranych komórek in vitro w celu uzyskania odpowiedniej ilości pożądanego produktu. Możliwe jest również wprowadzenie genu bezpośrednio do organizmu osoby leczonej (in vivo). W obu przypadkach stosuje się wektory do wprowadzania DNA.
Dostarczanie materiału genetycznego do komórki może mieć miejsce drogą bezpośrednią lub pośrednią.
Bezpośrednią metodą wprowadzania materiału genetycznego do organizmu jest wstrzyknięcie do tkanki roztworu DNA plazmidowego w soli fizjologicznej. Jest to tzw. nagi DNA (ang. naked) i jego stosowanie ma wiele zalet. Plazmidy są proste i tanie w wytwarzaniu, a ich podanie wywołuje nikłe efekty uboczne w postaci niewielkich odczynów zapalnych. W celu zwiększenie skuteczności dostarczania plazmidów do tkanek stosuje się tzw. metodę hydrodynamiczną, która polega na szybkim wstrzyknięciu do krwi dużej objętości płynu z plazmidowym DNA. Problemem w tym przypadku może być uszkodzenie narządów, dlatego szanse na zastosowanie tej metody w praktyce klinicznej są małe. Poza tym nagiego DNA nie można wprowadzać do komórek hodowanych in vitro.
Metody pośrednie wprowadzania kwasów nukleinowych możemy podzielić na fizyczne, biochemiczne i biologiczne:
• metody fizyczne umożliwiają na wprowadzenie kwasów nukleinowych do cytoplazmy lub jądra komórkowego poprzez lokalne i odwracalne uszkodzenie błony. Jedną z możliwości jest elektroporacja, czyli poddanie komórek działaniu krótkotrwałego impulsu elektrycznego o wysokim napięciu. Prowadzi to do wytworzenia w błonie porów o nanometrowej średnicy, które zanikają samoczynnie po upływie około 30 minut. Materiał genetyczny wnika przez otwarte pory bądź na skutek przemieszczania się składników plazmalemmy podczas ich zamykania. Metoda ta jest bardzo skuteczna, może się jednak wiązać z uszkodzeniem komórek. Obecnie może być stosowana nie tylko in vitro, ale również jako forma wspomagania transferu nagiego DNA do skóry, mięśni szkieletowych czy wątroby.
• metody biochemiczne polegają na zastosowaniu chemicznych nośników tworzących kompleksy z kwasami nukleinowymi. Najczęściej stosowane są lipidy kationowe (liposomy kationowe) lub polimery aminowe (oligodendrymery), które neutralizują ujemny ładunek kwasów nukleinowych. Kompleksy dostają się do komórki na drodze fagocytozy lub fuzji z błoną. Niektóre nośniki ułatwiają też uwolnienie materiału genetycznego z endosomu do cytoplazmy i chronią go przed aktywnością nukleaz. Pierwszym nośnikiem chemicznym zastosowanym in vitro był fosforan wapnia. Umożliwia on wprowadzenie jednocześnie kilku plazmidów do szybko dzielących się linii komórkowych, jednak efektywność transdukcji hodowli pierwotnych jest słaba. Skuteczniejszymi nośnikami są lipidy kationowe, często łączone z lipidami obojętnymi. Są one mało toksyczne, ale mogą wywołać aktywację niektórych komórek i powodować wytwarzanie cytokin prozapalnych. Liposomy mogą być stosowane do wprowadzania plazmidów in vivo, jednak ich skuteczne wykorzystanie napotyka na liczne bariery. We krwi kompleksy są narażone na atak komórek fagocytujących, DNA na strawienie przez nukleazy, zaś plazmidy mogą być zatrzymane w macierzy pozakomórkowej i nie dotrzeć do komórek docelowych. Bardziej popularną grupą nośników chemicznych są oligodendrymery zbudowane np. z polimerów poliamidoaminowych. Tworzą one gwiaździste lub sferyczne struktury z grupami aminowymi cząsteczki, nadając tym samym dendrymerom ładunek dodatni. Dzięki temu łatwo formują one kompleksy z kwasami nukleinowymi, które następnie dostają się do komórki na drodze fagocytozy. Mają one zastosowanie przy transformacji komórek in vitro, cechuje je duża wydajność, niski poziom cytotoksyczności i aktywacji komórek.
• metody biologiczne wykorzystują różnego rodzaju wektory, najczęściej wirusowe, tworzone poprzez usunięcie genów biorących udział w cyklu replikacyjnym wirusa i wprowadzeniu na ich miejsce genów terapeutycznych. Dobry wektor powinien skutecznie przenosić DNA do komórki docelowej i chronić gen terapeutyczny przed zniszczeniem. Ważnym zagadnieniem związanym z nośnikami genów jest celowana ekspresja genów w tkankach docelowych. Poza tym wektor powinien być trwały, nieimmunogenny oraz mieć zdolność pokonania bariery krew – guz.
Innym typem wektorów są plazmidy, czyli koliste cząsteczki DNA, które mogą replikować w komórkach gospodarza niezależnie od replikacji chromosomów. Otrzymuje się je metodą lizy zasadowej transformowanych bakterii E. coli oczyszczonych metodami chromatograficznymi. Możliwe jest uzyskanie dużych ilości mRNA kodujących białko lecznicze. Wklonowanie danego genu do plazmidu odbywa się w odpowiednich miejscach w plazmidzie, rozpoznawanych i ciętych przez enzymy restrykcyjne. Prowadzone są również badania z wykorzystaniem transpoznów oraz sztucznych chromosomów jako nośników genów.
Rodzaje wektorów wirusowych
– retrowirusowe, czyli cząsteczki RNA, które po przedostaniu się do komórki gospodarza przepisywane są na DNA i mogą integrować się z jego genomem. Dzięki temu zapewniają stabilną i długotrwałą ekspresję transgenu. Integracja ma jednak charakter przypadkowy, powstaje ryzyko wywołania mutacji. Wywodzą się one od wirusa mysiej białaczki Moloneya (ang. MLV – Moloney murine leukemia wirus). Stosowane są do dostarczania transgenów in vitro, bowiem in vivo są wrażliwe na degradację przez układ dopełniacza. Mają wiele zalet – łatwo się je otrzymuje i modyfikuje oraz łatwo wprowadza się do nich geny. Ich wadą jest to, że mogą zakażać jedynie komórki, które się dzielą. Wyjątek stanowią wektory lentiwirusowe, które mogą transdukować również komórki nie dzielące się. Obie grupy wektorów mają podobną wadę – wbudowują się do DNA jądrowego preferencyjnie w miejsca aktywne, tzn. takie, w których obecne są działające geny. Zwiększa to szanse na zaburzenie jakiegoś procesu, istnieje np. możliwość uruchomienia ekspresji onkogenów.
– adenowirusowe są jednymi z najbardziej popularnych nośników. Wnikają zarówno do komórek dzielących, jak i nie dzielących się. Transgen wprowadzony z ich udziałem wykazuje silną ekspresję, która jest jednak krótkotrwała. Wektory te mogą być stosowane do dostarczania do komórek bakteryjnych bardzo dużych fragmentów DNA, np. sztucznych chromosomów bakteryjnych (ang. BAC – bacterial artificial chromosome). Przyłączone DNA wraz z kapsydem wnika do komórki na drodze fagocytozy, po czym jest uwalniane z fagosomu do cytoplazmy. Ich wadą jest immunogenność – podanie wektorów adenowirusowych może wywołać zapalenie i odpowiedź cytotoksyczną przeciw zainfekowanym komórkom, co jest główną przyczyną wyciszenia ekspresji transgenu. Wykazano, że 90% populacji ludzkiej ma przeciwciała skierowane przeciw adenowirusom.
– wektory pochodzące od wirusów towarzyszących adenowirusom (ang. AVV – adeno-associated viruses) mogą transdukować komórki zarówno dzielące. jak i nie dzielące się. Nie indukują silnej odpowiedzi immunologicznej. Transgen wprowadzony przez nie pozostaje zazwyczaj w formie episomalnej (nie wbudowuje się do chromosomu gospodarza) lub integruje z przypadkowymi miejscami genomu. Dzikie wirusy AVV wbudowują się do genomu w ściśle określonym miejscu na chromosomie 19, co byłoby bardzo pożądaną cechą w terapii genowej, bowiem minimalizowałoby ryzyko indukcji mutagenezy inercyjnej przy zapewnieniu długotrwałej ekspresji transgenu. Jednak przy produkcji wektorów AVV dochodzi do usuwania wirusowego genu rep, który jest niezbędny do specyficznej integracji. Ponadto ograniczeniem tych wektorów jest niewielka pojemność – można w nim umieścić odcinek DNA do wielkości 5kb oraz mało wydajna produkcja. Są niepatogenne i nie powodują zapaleń ani reakcji odpornościowych. Zapewniają one długotrwałą ekspresję genów po podaniu in vivo do komórek nie dzielących się, np. mięśni szkieletowych.
– herpetowirusowe są obecnie poddawane intensywnym badaniom. Do ich wytwarzania wykorzystuje się dwa wirusy: wirus Epsteina-Barr (EBV) i wirus opryszczki (HSV). Do ich genomu można włączyć fragment DNA o wielkości 30-40kb. Wektory pochodzące od wirusa opryszczki stosowane są do transdukcji neuronów, zaś wektory EBV wnikają głównie do limfocytów B. Zapewniają długotrwałą ekspresję transgenu.
– pokswirusowe, pochodzą od wirusa krowianki, nie wbudowują się do genomu, charakteryzują się dużą pojemnością, silną ekspresją transgenu i możliwością transdukowania wielu typów komórek. Stosuje się je przy testach szczepionek genetycznych.
– Alfawirusowe, pochodzące z wirusów Semliki Forest lub Sindbis mogą transdukować komórki dzielące, jak i nie dzielące się, zarówno u kręgowców jak i bezkręgowców. Zapewniają wysoki poziom ekspresji transgenu, hamują jednak syntezę wielu białek endogennych oraz mogą być toksyczne dla komórek.
– bakulowirusowe pochodzą z bakulowirusów z podrodziny wirusów jądrowej poliedrozy. Mogą replikować jedynie w komórkach owadów łuskoskrzydłych, dlatego przygotowuje się je w hodowlach odpowiednich komórek owadzich. Można je stosować do wprowadzania transgenów do komórek ssaczych. Wnikają do komórek na drodze fagocytozy, zapewniają episomalną ekspresję transgenu, nie są toksyczne dla komórki.
Blokowanie biosyntezy wadliwych produktów białkowych
Hamowanie ekspresji zmutowanych genów możliwe jest dzięki zastosowaniu:
• terapii antysensu, czyli zablokowaniu ekspresji zmutowanego genu przy udziale krótkich, syntetycznych odcinków komplementarnych oligonukleotydów. Wprowadzony odcinek antysensownego oligo-DNA (lub –RNA) łączy się ze zmutowanym mRNA będącym produktem transkrypcji uszkodzonych genów. Skutkuje to w blokowaniu translacji białek i ekspresji zmutowanego genu.
• struktur tripleksu – polega na hamowaniu aktywności genomowego DNA, na którym zlokalizowane są zmutowane geny, poprzez łączenie wprowadzonych oligonukleotydów z dwuniciowym DNA w struktury tripleksowe.
• rybozymów – krótkich odcinków RNA o specyficznej sekwencji zasad mających zdolność do samotrawienia i enzymatycznego cięcia innych cząsteczek mRNA. Takie cięcie może osłabiać lub zapobiegać translacji odpowiednich białek.
• struktury Z-DNA – o nietypowej zygzakowatej budowie powstającej podczas transkrypcji RNA. W USA opracowano lek, który łącząc się z taka strukturą w rejonie genów kodujących kinazy białkowe hamuje ich aktywność, co wpływa na procesy nowotworowe.
• interferencji RNA, czyli potranskrypcyjnego wyłączania genów. Dwuniciowa cząsteczka RNA (siRNA – small interfering RNA) wywołuje degradacje mRNA, co z kolei blokuje proces translacji i ekspresji danego genu. Działanie siRNA wywołuje degradację wielu cząsteczek mRNA, działa więc efektywniej i bardziej selektywnie wobec mRNA.
Zastosowanie genoterapii
Poprzez zastąpienie w komórkach wadliwie działających genów ich sprawnymi kopiami mogą być leczone choroby genetyczne będące wynikiem mutacji jednego genu, tj.: mukowiscydoza, hemofilie A i B, dystrofia mięśniowa Duchenne’a, SCID, rodzinna hipercholesterolemia, fenyloketonuria, anemia sierpowata. Dzięki wprowadzaniu prawidłowych genów terapeutycznych w chorobach powstałych jako wynik mutacji wielu genów możliwe jest leczenie: miażdżycy, choroby Parkinsona, chorób tkanki łącznej oraz chorób nowotworowych, które powstają na skutek gromadzenia się uszkodzeń materiału genetycznego. Techniki antysensu są stosowane w leczeniu chorób wątroby, raka trzustki czy piersi. Rybozymy maja zastosowanie w genoterapii chorób wirusowych: blokuje się tą metodą namnażanie brodawczaka ludzkiego, czynnika prowadzącego do transformacji nowotworowej, w wyniku której powstaje rak skóry, sromu i ust. Trwają również badania nad zastosowaniem ich w leczeniu starczego zwyrodnienia plamki żółtej, wirusowych infekcji górnych dróg oddechowych, chorobach nowotworowych i metabolicznych.
Nadzieje terapii genowej
Nadal pozostają nadziejami. Problemem może okazać się zbyt niski poziom ekspresji wprowadzonego genu, by móc uzyskać efekt terapeutyczny. Także dostępność komórek nie jest wystarczająca – idealna powinna żyć wiecznie i być łatwo dostępna. Komórki macierzyste szpiku spełniają te zadania, jednak wcale nie łatwo je uzyskać. Poza tym, jeśli nie są to komórki typu macierzystego, terapia musi być powtarzana wielokrotnie, co wzmaga ryzyko powstawania reakcji zapalnych czy odpornościowych. Innym problemem jest unieczynnianie wprowadzonych genów poprzez metylację, którą trudno jest sterować a zachodzi często. Terapia genowa rodzi też problemy natury etycznej – badania są prowadzone na hodowlach komórkowych, potem na myszach a następnie niezbędne są wyniki z eksperymentów na ludziach. Osoby takie muszą być poinformowane o możliwym ryzyku, które często trudno ocenić. Potencjał badań nad genoterapią jest jednak znaczny i dziedzina ta stać się może szeroko dostępna i skuteczna. Wówczas stanowić będzie uzupełnienie w leczeniu chirurgicznym, radiologicznym i metodami konwencjonalnymi.
Autor: Karolina Podsiadły
Literatura:
1. Barańska M., Skrętowicz J.: Perspektywy terapii genowej. Wiadomości Lekarskie 2007, 60 (7-8):305-311
2. Bartnik E.: Terapia genowa: obietnice i rzeczywistość. Biologia w szkole 2006, 3:12-16
3. Dulak J.: Czy powinniśmy się obawiać terapii genowej? Diametros 2009, 19:40-47
4. Józkowiak A., Dulak J.: Nowe strategie wykorzystania wektorów plazmidowych i wirusowych w terapii genowej. Biotechnologia 2007, 3(78):7-21
