Barwienie Grama jest jednym z najpowszechniejszych testów taksonomicznych stosowanych w mikrobiologii. Za jego pomocą można podzielić bakterie na dwie podstawowe grupy: gramujemne (G-) i gramdodatnie (G+), różniące się od siebie składem i budową ściany komórkowej oraz pewnymi cechami fizjologicznymi, np. podatnością na leki.
Początki
Orginalny zapis metody barwienia Grama ukazał się po raz pierwszy w 1884 r., na łamach „Fortschitte der Medicin” (tom 2, strony 185-189) w publikacji zatytułowanej “Barwienie różnicowe Schizomycetes w skrawkach tkanek i suszonych preparatach”. Jej autor, duński bakteriolog Hans Christian Gram (1853-1923), nie był wówczas świadomy wartości taksonomicznej wynalezionej przez siebie techniki. Stosował ją do uwidaczniania komórek bakteryjnych znajdujących się w zakażonych tkankach.
Opisana przez niego procedura różni się od używanej obecnie metody. Barwnikiem podstawowym była mieszanina aniliny i fioletu gencjanowego, a bejcą był płyn Lugola. Do odbarwienia komórek służył alkohol absolutny, natomiast barwienie dodatkowe wykonywano za pomocą brunatu Bismarcka (ang. Bismarc Brown).
Wykonanie
1. Z młodych kultur sporządzić hodowlę płynną zawierającą żywe komórki bakteryjne.
2. Jedną kroplę z hodowli płynnej przenieść na odtłuszczone szkiełko podstawowe i z pomocą ezy wykonać cienki, jednorodny rozmaz. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia.
3. Preparat utrwalić za pomocą metanolu lub termicznie, to znaczy poprzez trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika. Przed barwieniem należy ostudzić szkiełko tak, żaby miało ono temperaturę pokojową. W przypadku utrwalania chemicznego należy wypłukać metanol.
4. Obmyć szkiełko barwnikiem podstawowym, tzn. fioletem krystalicznym, metylowym lub gencjanowym (1 – 3 minuty).
5. Przepłukać wodą destylowaną.
6. Obmyć tzw. bejcą, zaprawą, czyli roztworem jodu (0,5 – 2 minuty).
7. Przepłukać wodą destylowaną.
8. Odbarwić etanolem lub acetonem (30 sekund).
9. Przepłukać wodą destylowaną.
10. Podbarwić preparat barwnikiem dodatkowym, np. fuksyną zasadową, czerwienią neutralną (30 sekund).
11. Przepłukać wodą destylowaną.
12. Osuszyć bibułą lub papierowym ręcznikiem i pozostawić do wyschnięcia.
Efekt barwienia można oglądać pod mikroskopem imersyjnym, przy powiększeniu 1000x (okular 10x, obiektyw 100x).
W celu kontroli jakości barwienia dobrze jest wykonać równocześnie dodatkową próbę sporządzoną ze znanego szczepu.
Rys. 1. Barwienia metodą Grama – wykonanie i wynik (opis w tekście)
Interpretacja wyników
Z użyciem barwienia Grama większość bakterii można podzielić na dwie podstawowe grupy:
• gramdodatnie (G+, Gram +), np. ziarniaki, laseczki, maczugowce, promieniowce – barwią się na fioletowo;
• gramujemne (G-, Gram-), np. pałeczki, Pseudomonas, przecinkowce i śrubowce – przybierają barwę różową.
Metoda ta pozwala również uwidocznić kształt badanej komórki, określić jej rozmiar oraz inne szczegóły strukturalne. Stanowi ona zatem źródło wstępnych informacji taksonomicznych o badanym szczepie.
Zasada metody
Różnice w sposobie barwienia bakterii wynikają ze składu i budowy ich ściany komórkowej. Barwnik podstawowy tworzy z jodem kompleksy na tyle duże, że nie mogą być wymyte ze ścian bakterii gramdodatnich – grubszych i bogatszych w peptydoglikan. Komórki te, nawet po przepłukaniu alkoholem, pozostają zabarwiane na niebiesko, a po dodaniu barwnika pomocniczego przybierają barwę fioletową. Przepłukane alkoholem bakterie gramujemne ulegają odbarwieniu i uwidaczniają się dopiero dzięki obecności dodatkowego barwnika o barwie różowej.
Rys. 2. Budowa ściany komórkowej bakterii gram dodatnich i gramujemnych
Szczepy gramujemne i gramdodatnie różnią się od siebie pod wieloma względami, gdyż budowa ściany komórkowej wpływa na ich właściwości fizjologiczne.
Tab. 1. Różnice pomiędzy bakteriami gramdodatnimi i gramujemnymi
Wady metody
Barwienie metodą Grama jest stosunkowo prostą techniką, wymagającą jednak pewnej wprawy od wykonującej ją osoby.
Jedną z jej podstawowych wad jest niewątpliwie duża ilość stosowanych barwników i sposób ich aplikacji, który uniemożliwia utrzymanie czystości w miejscu pracy.
Należy również pamiętać, że pewne typy bakterii mogą różnie reagować na barwienie. Przykładowo Mycobacterium posiadają w swojej ścianie komórkowej dużo substancji woskowych i w związku z tym ich uwidocznienie nie jest łatwe. Również bakterie o małych rozmiarach takie jak Treponema, Chlomydia, Rickettsia trudno jest wybarwić klasyczną metodą Grama. Pozytywną reakcję mogą natomiast dawać niektóre gatunki grzybów, takie jak Candida i Cryptococcus.
Na wynik barwienia może wpływa również stres, czyli brak składników pokarmowych, zbyt wysoka temperatura (np. podczas utrwalania nad palnikiem), pH i zawartość elektrolitów. Nie bez znaczenia jest również wiek badanej hodowli. Bacillus i Clostridium wraz z wiekiem tracą zawartość peptydoglikanu, natomiast ulegające kolejnym podziałom bakterie Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium i Propionibacterium są coraz bardziej narażone na uszkodzenia ściany komórkowej. Każde naruszenie integralności komórki jest przyczyną błędnych wyników. Barwienie Grama można zatem stosować jedynie w przypadku nieuszkodzonych bakterii.
Tab.2. Modyfikacje barwienia Grama
Autor: Anna Kurcek
Literatura:
1. BD (ang. Becton, Dickinson and Company), 2006. Zestawy I odczynniki do barwienia metodą Grama.
2. Kunicki-Goldfinger W., 1977. Podstawy mikrobiologii i immunologii. Wydawnictwo PWN. Warszawa.
3. Sizemore R. K., Caldwell J. J., Kendrick A. S., 1992. Alternate Gram Staining Technique Using a Fluorescent LActin. Applied and Environmental Microbiology. 57(7): 2245-2247.
4. Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections. 2007. Staining Procedures.
5. http://www.microrao.com
